1、第五章第五章 基因治疗基因治疗Gene Therapy一、概念一、概念 经典的基因治疗经典的基因治疗：指正常的基因整合入指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。种治疗方法。广义的基因治疗广义的基因治疗：将某种遗传物质转移将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。以达到治疗疾病目的的方法。1.基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somatic cell)(somatic cell)基因治疗基因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)(germline)基因治疗基因治疗
2、v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代 1990年年9月月14日：第一例正式批准的基因治疗日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行实验开始进行（美国美国，世界上开展基因治疗最早的国家），世界上开展基因治疗最早的国家）大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：段：体外试验和动物试验体外试验和动物试验 I期临床试验期临床试验6-10名志愿者名志愿者 II期临床试验期临床试验20-30名志愿者名志愿者 III期临床试验期临床试验充
3、分分析疗效、安全性充分分析疗效、安全性中国：中国：1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验2.基因治疗发展简史基因治疗发展简史 世界上第一个正式被批准用于基因世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶先天性腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症缺乏症。1990 1990年年9 9月美国月美国BlaeseBlaese博士成功地将博士成功地将正常的人的正常的人的ADAADA基因植入基因植入ADAADA缺乏症病人缺乏症病人的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。试验。腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)缺乏的缺乏的严重联合
4、免疫缺陷严重联合免疫缺陷(SCID)(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略：淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状治疗基本步骤治疗基本步骤:ADA基因基因+逆转录病毒载体逆转录病毒载体导入患者导入患者淋巴细胞淋巴细胞体外扩增体外扩增回输回输病人体内病人体内淋巴细胞淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能维持免疫系统功能,改善病人症状改善病人症状 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略The Strategy
5、 of Gene Therapy （一）基因置换（一）基因置换（gene replacementgene replacement）定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原置换基因组内原有的缺陷基因有的缺陷基因。目的目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。又称为又称为基因打靶基因打靶(gene targeting）定点整合的条件定点整合的
6、条件:转导基因的载体与染色转导基因的载体与染色体上的体上的DNA具有相同的序列。具有相同的序列。带有目的带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。治疗策略得以实现。基因同源重组技术基因同源重组技术 要实现基因置换，需要采用要实现基因置换，需要采用同源重组技同源重组技术术使相应的正常基因使相应的正常基因定向定向导入受体细胞导入受体细胞的基因缺陷部位。的基因缺陷部位。定向定向导入的发生率约导入的发生率约1/1001/100万万，采用，采用胚胚胎干细胞胎干细胞培养的方法，这
7、种同源重组的培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。基因置换必要条件：基因置换必要条件：1、对导入的基因及其产物有详尽的了解、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害无害（二）（二）基因添加基因添加 基因添加基因添加或称或称基因增补基因增补（gene augmentationgene augmentat
8、ion）:通过导入外源基因通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达使靶细胞表达其本身不表达的基因。的基因。类型类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因导入靶细胞本来不表达的基因，利，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。用其表达产物达到治疗疾病的目的。基因干预基因干预(gene interferencegene interference)指采用特定的方式抑制某
9、个基因的表达，指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。治疗疾病的目的。1.反义核酸反义核酸：封闭基因表达封闭基因表达2.核酶：核酶：裂解特异的靶裂解特异的靶mRNA3.RNA干涉技术：干涉技术：（三）基因干预（三）基因干预（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗 自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。要方法之一。原理原理:将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物前体
10、转化为细胞毒性代谢物，诱导靶，诱导靶细胞产生细胞产生“自杀自杀”效应，从而达到清效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。除肿瘤细胞的目的。自杀基因的作用机制 1.1.自杀基因系统自杀基因系统 TK/GCVTK/GCV 单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（herps simplex virus,herps simplex virus,HSVHSV）型胸苷激酶型胸苷激酶（thymidine kinase,thymidine kinase,tktk）基因编码胸苷激酶，基因编码胸苷激酶，胸苷激酶胸苷激酶特异性地将无毒的核苷类似物特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷丙氧鸟苷（ganciclovir,ganciclovi
11、r,GCVGCV）转变成）转变成毒性毒性GCVGCV三磷酸核三磷酸核苷苷，后者能抑制后者能抑制DNADNA聚合酶活性，导致细胞死亡。聚合酶活性，导致细胞死亡。CD/5-FC CD/5-FC 大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶（cytosine cytosine deaminase,deaminase,CDCD）基因，）基因，胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性在细胞内将无毒性5-5-氟胞嘧啶氟胞嘧啶（5-FC5-FC）转变成毒性产物）转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU5-FU）。）。5-5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶通过竞争性抑制通过竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶的活性，的活性
12、，从而从而抑制脱氧胸苷三磷酸抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。的合成。旁观者效应旁观者效应:“自杀基因自杀基因”治疗不仅使转导治疗不仅使转导了了“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导而且与其相邻的未转导“自杀基因自杀基因”的肿瘤细的肿瘤细胞也被杀死。胞也被杀死。2.2.旁观者效应旁观者效应（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。癌免疫反应。二、基因治疗的必要条件二、基因治疗的必要条件1.发病机
13、制在发病机制在DNA水平上已经清楚；水平上已经清楚；2.要转移的基因已经克隆分离，其表达产要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；物有详尽的了解；3.该基因正常表达的组织可在体外进行遗该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；传操作；1.外源基因可有效导入靶细胞外源基因可有效导入靶细胞2.外源基因能在靶细胞中长期稳定存留外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3.导入基因能适量表达导入基因能适量表达4.导入基因的方法及载体对宿主细胞安全导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害无害理想的基因治疗还必须：理想的基因治疗还必须：二、基因转移技术二、基因转移技术 The Technique of Ge
14、ne Transfer 基因治疗途径基因治疗途径 1、间接体内治疗途径（、间接体内治疗途径（ex vivo)是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂）易控制但操作复杂）2 2、直接体内治疗途径（、直接体内治疗途径（in vivoin vivo）将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体将目的基因体内直接转
15、移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）单但疗效短、免疫排斥等）基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞 基因转移基因转移(gene transfer)(gene transfer)技术：技术：1.1.病毒介导的基因转移系统。病毒介导的基因转移系统。2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。因
16、此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是是逆转录病毒载体逆转录病毒载体。具有包膜，圆球状，直径为具有包膜，圆球状，直径为8080 120nm120nm 基因组是基因组是单正链单正链RNARNA，3.53.5 9.0kb9.0kb 病毒颗粒中有病毒颗粒中有逆转录酶逆转录酶 能整合于宿主细胞的染色体能整合于宿主细胞的染色体 （1 1）逆转录病毒）逆转录病毒（Retroviruses）逆转录病毒颗粒结构逆转录病毒颗粒结构RNA逆转录酶逆转录酶衣壳蛋白衣壳蛋白基
17、质蛋白基质蛋白包膜包膜gp120gp41 Reverse transcription Integration Transcription PackagingLifecycle of retrovirus逆转录病毒逆转录病毒整合入宿主整合入宿主DNADNA中的分子机制，其本质是中的分子机制，其本质是转座转座LTR(long-terminal repeat):长末端重复序列长末端重复序列Provirus(原病毒原病毒):被被整合整合到细胞基因组中的逆到细胞基因组中的逆转录病毒序列转录病毒序列3 formsTwo fates of RNA:Translation:作为作为mRNAmRNA翻译成病毒的
18、蛋白质翻译成病毒的蛋白质 Packaging：作为病毒作为病毒RNARNA基因组被装配成新的基因组被装配成新的病毒颗粒病毒颗粒Everything is ready!Packaging2 RNAs in 1 virusHIV 从受感染细胞的质膜出芽的情形从受感染细胞的质膜出芽的情形逆转录病毒的产生包括将逆转录病毒的产生包括将RNA包装到衣壳中，包装到衣壳中，然后从细胞的细胞膜上得到部分膜，出芽释放。然后从细胞的细胞膜上得到部分膜，出芽释放。调节和调节和启动转录启动转录 LTR gag pol env LTR核心蛋白质核心蛋白质(Nucleoprotein core)编码逆转录编码逆转录酶和整合
19、酶酶和整合酶(integrase)编码病毒外壳编码病毒外壳蛋白质蛋白质(Envelope)Genome Structure of Retrovirus（1 1）两端各有一）两端各有一长末端重复序列长末端重复序列LTRLTR。（2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。(1)(1)在在U3U3内有内有增强子增强子和和启动子启动子；(2)U3(2)U3和和U5U5两端分别有两端分别有病毒整合序列病毒整合序列(IS)(IS)；(3)(3)在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号加尾信号。逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 （3 3
20、）病毒有三个结构基因）病毒有三个结构基因(1)(1)gaggag基因基因，编码核心蛋白；，编码核心蛋白；(2)(2)polpol基因基因，编码逆转录酶和整合酶；，编码逆转录酶和整合酶；(3)(3)envenv基因基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。（4 4）55端端LTRLTR下游有一段病毒包装所必需的下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列包装信号序列（）及）及剪接供体位点剪接供体位点(SD)(SD)和和剪接受体位点剪接受体位点(SA)(SA)。逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 构成逆转录病毒介导的基
21、因转移系统构成逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒载体逆转录病毒载体由两部分组成：由两部分组成：(1)(1)保留病毒颗粒的包装信号保留病毒颗粒的包装信号而而缺失病毒缺失病毒蛋白基因蛋白基因 (2)(2)辅助细胞株辅助细胞株(如如PA317)PA317)：它由缺陷型：它由缺陷型逆转录病毒感染构建而成逆转录病毒感染构建而成Retroviral packaging system目的基因标记基因目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体逆转录病毒载体重组逆转录病毒重组逆转录病毒(核酸部分只能是核酸部分只能是逆转逆转录病毒载体录病毒载体)辅病毒辅病
22、毒 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白编码的糖蛋白，能够被许能够被许多哺乳动物细胞膜上的多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别特异性受体识别，从而使，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响的缺失不影响其他部分的活性。其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的包装好的假
23、病毒颗粒假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。液中，易于分离制备。逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 kb7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。（2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AVAV)载体载体 腺病毒腺病毒是一种大分子是一种大分子(36 kb)(3
24、6 kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒病毒。它通过受体介导的它通过受体介导的内吞作用内吞作用进入细胞内，进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，宿主细胞范围广，可感可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。纤毛纤毛腺病毒的优点腺病毒的优点1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对
25、人类安全；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点2.2.宿主的免疫反应导致宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂腺病毒载体表达短暂。3.3.有两个环节有两个环节可能产生复制型腺病毒可能产生复制型腺病毒。4.4.靶向性差。靶向性差。1.1.不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组DNADNA中
26、中。分裂增殖快。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。机会增多，表达时间相对较短。(1)(1)腺病毒产生过程中与腺病毒产生过程中与293293辅助细胞辅助细胞内内E1E1区序列发生同区序列发生同源重组；源重组；(2)(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。AAV Virus Particles（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(ad
27、enovirus associated virus(adenovirus associated virus，AAVAAV)是一类是一类单链线状单链线状DNADNA缺陷型病毒缺陷型病毒。其基因组其基因组DNADNA小于小于5 kb5 kb，无包膜，外形为裸露的，无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒。面体颗粒。AAVAAV不能独立复制不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染。Structure of
28、AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因编码衣壳蛋白的基因AAVAAV的特点的特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表达就处于基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAVAAV基因基因表达从而使表达从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。建立新的潜伏状态。AAVAAV载体是目前正在
29、研究的一类新型安全载体，载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。它对人类无致病性。AAVAAV可以高效可以高效定点整合定点整合至人至人1919号染色体的特定号染色体的特定区域区域19q13.419q13.4中，并能较稳定地存在。中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优
30、点。载体两者的优点。AAVAAV载体的缺陷：载体的缺陷：AAVAAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 kb5 kb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低。感染效率比逆转录病毒载体低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统（1 1）脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用利用阳离子脂质体单体阳离子
31、脂质体单体与与DNADNA混合后，可以自动混合后，可以自动形成包埋外源形成包埋外源DNADNA的脂的脂质体质体，然后与细胞一起孵育，即可通过，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞细胞内吞作用内吞作用将外源将外源DNADNA（即目的基因）（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。转移至细胞内，并进行表达。THANK YOUSUCCESS2022-10-760可编辑 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导法缺点脂质体介导法缺点：脂质体介导进入靶细胞内，脂质体介导进入靶细胞内，易被单核易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。缺点：受体介导的缺点：受体介导
32、的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。通常进入细胞溶酶体内被降解。（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNADNA与与细胞细胞或组织亲和性的或组织亲和性的配体配体偶联，可使偶联，可使DNADNA具有靶向性。具有靶向性。这种偶联通常通过这种偶联通常通过多聚阳离子多聚阳离子（如多聚赖氨酸）（如多聚赖氨酸）来实现。来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相通过电荷相互作用与带负电荷的互作用与带负电荷的DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围包围，只，只留下配体暴露于表面。留下配体暴露于表面。这样形成的复合物这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细可
33、被带有特异性受体的靶细胞吞饮，胞吞饮，从而将外源从而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图（3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够按其基因的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，将促进心脏血管生长的基
34、因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；病所缺少的胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。血因子等等。基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.1.制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNA重组体的技术较重组体的技术较容易；容易；2.2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.3.导入的
35、基因不需整合即可表达导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；止或逆转的缺点；4.4.基因直接注射法可反复使用基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。三、基因转移的靶细胞三、基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：靶细胞的选择须考虑：1.容易取出和移植。血液系统的细胞、成纤容易取出和移植。血液系统的细胞、成纤维细胞、成肌细胞；维细胞、成肌细胞；2.细胞具有较长的寿命细胞具有较长的寿命3.离体细
36、胞较易受外源基因转化离体细胞较易受外源基因转化4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活体内，仍较易成活体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞目前常用的靶细胞有：目前常用的靶细胞有：1.造血细胞造血细胞2.皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞3.肝细胞肝细胞4.血管内皮细胞血管内皮细胞5.淋巴细胞淋巴细胞6.肌肉细胞肌肉细胞7.肿瘤细胞肿瘤细胞三、基因干预三、基因干预 Gene Interference主要干扰特定细胞的主要干扰特定细胞的mRNA转录和翻译转录和翻译基因干预的种类：基因干预的种类：1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(ant
37、isense RNA)2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)3.3.核酶核酶 (ribozyme)（一）反义（一）反义RNARNADefinition:反义反义RNA（Antisense RNA)：指与靶指与靶RNA(或或DNA)具有互补序列的具有互补序列的RNA分子。分子。反义反义RNA技术技术 通过通过体外合成的反义体外合成的反义RNA或或构建能构建能转录反义转录反义RNA的重组的重组DNA质粒质粒转入细胞转入细胞中，利用中，利用碱基互补原理碱基互补原理结合细胞中特异结合细胞中特异mRNA以调控其表达。以调控其表达。类反义类反义
38、RNA直接直接作用于靶作用于靶mRNA的的S D序序列和列和(或或)部分编码区，部分编码区，直接抑制翻译，或直接抑制翻译，或与与靶靶mRNA结合形成双链结合形成双链RNA，从而易被从而易被RNA酶酶 降解；降解；类反义类反义RNA与与mRNA的非编码区结合，的非编码区结合，引起引起mRNA构象变化，抑制翻译；构象变化，抑制翻译；类反义类反义RNA则则直接抑制靶直接抑制靶mRNA的转录的转录 1.根据反义根据反义RNA的作用机制分为的作用机制分为 反义寡聚核反义寡聚核苷酸（苷酸（类）类）与与mRNA特特异性结合，异性结合，阻断翻译过阻断翻译过程程 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行
39、基因表达对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义体外合成反义RNARNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。缺点：缺点：RNARNA易降解易降解（2 2）构建能转录反义构建能转录反义RNARNA的重组质粒的重组质粒，将质粒，将质粒转入细胞，转录出反义转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用而发挥作用缺点：细胞内转录的反义缺点：细胞内转录的反义RNARNA量不易控制量不易控制2.反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控 反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术
40、问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题 专一性转移问题：如何解决某一组织、器官专一性转移问题：如何解决某一组织、器官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。3.受体介导反义受体介导反义RNA转移技术转移技术 受受受体介导受体介导DNADNA转移方法转移方法的启发把的启发把DNADNA换成反义换成反义RNARNA，就可以实现受体介导就可以实现受体介导的反义的反义RNARNA的转移。的转移。将将脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGPASGP）与）与多聚赖氨多聚赖氨酸酸（PLPL）共价连接，得到）共价连接，得到ASG
41、P-PLASGP-PL复合物复合物，成，成为运载核酸的工具。为运载核酸的工具。结合反义结合反义RNARNA，成为成为ASGPPLASGPPL反义反义RNARNA复合物复合物 ASGP-PLASGP-PL反义反义RNARNA复合物可以复合物可以专一性地被肝细专一性地被肝细胞表面的胞表面的ASGPASGP受体所识别受体所识别，并吞噬到肝细胞中，并吞噬到肝细胞中，反义反义RNARNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。挥作用。例：例：受体介导的受体介导的RNARNA转移十分转移十分专一专一，而且效，而且效率高；率高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环
42、境是被保护的，与周围环境之间存在之间存在多聚赖氨酸的保护层多聚赖氨酸的保护层,可以可以抵抵抗环境中的核酸酶的降解作用抗环境中的核酸酶的降解作用。4.反义反义RNA的应用（一）的应用（一）利用反义利用反义RNA的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法：阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体基因突变体mRNA成熟成熟 原癌基因原癌基因 调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化 正常情况下，表达受严格控制正常情况下，表达受严格控制 一旦调节失控，基因产物（生长因一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信子，生长因子受体，胞内外传递信
43、号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌增生，致癌 根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA 相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的化表达的mRNA的起始翻译位点结合成的起始翻译位点结合成RNA/RNA双链体双链体 双链体阻止核糖体的结合，或核糖体沿双链体阻止核糖体的结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译上移，抑制翻译治疗方法治疗方法 抗抗HIV-l的作用的作用：从翻译水平封闭基从翻译水平封闭基因表达，并干扰因表达，并干扰mRNA的剪切、加的剪切、加工而实现抗病毒作用工而实现抗病毒作用 反义反
44、义RNA的应用（二）的应用（二）tat为为HIV-l重要的调节基因重要的调节基因，编码，编码反式激活反式激活因因子子 Tat蛋白蛋白,它能增强它能增强HIV-1基因转录起始和延基因转录起始和延伸的效率伸的效率.TAR序列序列是是TAT激活激活HIV基因表达所必需的效基因表达所必需的效应元件。处于应元件。处于LTR的的R区内。区内。Tat结合到结合到TAR的茎环结构上。的茎环结构上。Tat可与可与RNA结合因子一起以复合体形式结合在结合因子一起以复合体形式结合在转录物的转录物的TAR序列上，并与装配在启动子处的转序列上，并与装配在启动子处的转录起始复合体作用，录起始复合体作用，这种作用导致这种作
45、用导致TFH的激酶活性被激活，结果的激酶活性被激活，结果RNA聚合酶聚合酶的羧基端结构域的羧基端结构域(CTD)实现磷酸化，实现磷酸化，使得使得RNA聚合酶前进，完成聚合酶前进，完成HIV转录单位的阅读，转录单位的阅读，实现实现HIV蛋白的大量合成。蛋白的大量合成。抗抗HIV-l策略策略 在逆转录病毒启动子在逆转录病毒启动子LTR之后之后连接反义连接反义tat与多聚与多聚TAR的构建物的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反义具有反义tat及及TAR诱饵的双诱饵的双重作用重作用 gag是是HIV-1的结构基因，编码的结构基因，编码p24等病等病毒结构蛋白毒结构蛋白 Veres等构建
46、了逆转录病毒载体，在细等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于胞内表达互补于gag区不同长度的反义区不同长度的反义RNA(225-1225nt)在在CEM-SS T细胞及外周血细胞及外周血CD4细胞均细胞均有抑制有抑制HIV-l复制的作用复制的作用 长片段反义长片段反义RNA的抗的抗HIV-l作用更好，作用更好，可能由于它能与不同种的可能由于它能与不同种的HIV-l RNA结结合而限制了病毒的逃逸合而限制了病毒的逃逸 3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。
47、而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计设计 和制备方便和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反义反义RNARNA只作用于特异的只作用于特异的mRNAmRNA分子，分子，不改变所调节基因的结构。反义不改变所调节基因的结构。反义RNARNA分分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留降解，不留“残渣残渣”。在治疗在治疗RNARNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNARNA基基因
48、治疗比一般的因治疗比一般的DNADNA基因治疗有更大的优势。利用反义基因治疗有更大的优势。利用反义RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNARNA，阻断，阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象 （二）干扰（二）干扰RNARNA 对对RNARNA干扰的认识来源于用干扰的认识来源于用线虫线虫（C.elegansC.elegans）和和果蝇果蝇所进行的实验。所进行的实验。实验结果显示，有义链实验结果显示，有义链RNARNA（sense RNAsense RNA）或反）或反义链义链RNARNA（antisense RNAantisense RNA）均能
49、抑制线虫基因）均能抑制线虫基因的表达，双链的表达，双链RNARNA比单链比单链RNARNA更为有效。更为有效。将特异的双链将特异的双链RNARNA注入线虫体内注入线虫体内可抑制有同源可抑制有同源序列的基因的表达。序列的基因的表达。得到的结果是得到的结果是有义链有义链RNARNA和反义链和反义链RNARNA都同样阻断基因表达途径。都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义这与传统上对反义RNARNA技术的解释正好相反。技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义而且其抑制基因表达的效率比反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。个数量级。RNA RNA干扰干扰（RNA interferen
50、ceRNA interference，RNAiRNAi）是一种是一种由双链由双链RNARNA诱发的基因沉默现象诱发的基因沉默现象。在。在此过程中，与双链此过程中，与双链RNARNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNARNA（mRNAmRNA）被降解，从而抑制该基因的表）被降解，从而抑制该基因的表达。达。2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有2 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性小干扰性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNARNA诱导的
