1、疫苗临床前研究指导疫苗临床前研究指导原则原则l本指导原则适用于用病毒、细菌或其他本指导原则适用于用病毒、细菌或其他病原微生物制备的预防用疫苗，其目的病原微生物制备的预防用疫苗，其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，指是为该类制剂提供一个共同的原则，指导制定临床前研究的方案，和确定具体导制定临床前研究的方案，和确定具体的研究内容。的研究内容。2疫苗临床前研究指导原则l一、基本原则一、基本原则（一）应符合国家药品管理法等相（一）应符合国家药品管理法等相关法律法规的要求；关法律法规的要求；（二）对所预防的疾病的流行情况进行（二）对所预防的疾病的流行情况进行研究研究,包括疾病的危害程度所涉及的人群包括
2、疾病的危害程度所涉及的人群及病原的型和亚型等；及病原的型和亚型等；（三）对研制该类制品用于预防疾病的（三）对研制该类制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析；有效性、安全性及必要性进行分析；3疫苗临床前研究指导原则l（四）应对该制品用于预防该疾病的利（四）应对该制品用于预防该疾病的利益风险比进行研究。根据该制品的预防益风险比进行研究。根据该制品的预防方案可能达到的效果及可能出现的副作方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能
3、否作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。获得批准的重要依据之一。4疫苗临床前研究指导原则二、用于疫苗研究用的菌毒种二、用于疫苗研究用的菌毒种研究疫苗所用的研究疫苗所用的菌毒种菌毒种必须证明为引必须证明为引起本病的细菌、病毒或其他病原体，如该起本病的细菌、病毒或其他病原体，如该菌毒株分离自人体，下述内容必须清楚。菌毒株分离自人体，下述内容必须清楚。（一）菌毒株名称及来源：（一）菌毒株名称及来源：1菌毒株名称菌毒株名称2菌毒株来源菌毒株来源 （1）分离菌毒株的宿主一般情况；）分离菌毒株的宿主一般情况；（2）发病地点、发病日期；临床确诊日期、实验）发病地点、发病日期；临床确诊日期
4、、实验室确诊日期；病人病程及病人转归。室确诊日期；病人病程及病人转归。5疫苗临床前研究指导原则l菌、毒种系指直接用于制造和检定生物菌、毒种系指直接用于制造和检定生物制品的细菌、立克次体或病毒。制品的细菌、立克次体或病毒。6疫苗临床前研究指导原则3菌毒株分离原样本：菌毒株分离原样本：咽试子、漱口液、咽试子、漱口液、痰液、血液、粪便、尿液、尸解标本的组痰液、血液、粪便、尿液、尸解标本的组织名称；取样日期；取样时病人的病期。织名称；取样日期；取样时病人的病期。4鉴于人类的血液在同一时间内较少感染鉴于人类的血液在同一时间内较少感染多种病毒或细菌，而咽试子、漱口液、痰多种病毒或细菌，而咽试子、漱口液、痰
5、液、尿液、粪便等样品难免污染其他外源液、尿液、粪便等样品难免污染其他外源因子，因此用病人血液分离的菌、毒株较因子，因此用病人血液分离的菌、毒株较适宜用于研究疫苗。适宜用于研究疫苗。5分离菌、毒株的其他自然样本名称、来分离菌、毒株的其他自然样本名称、来源、数量、取样方法等。源、数量、取样方法等。7疫苗临床前研究指导原则l（二）菌、毒株分离过程（二）菌、毒株分离过程1用细胞分离病毒，所用细胞名称、代次、用细胞分离病毒，所用细胞名称、代次、来源应清楚，应进行细胞无菌检测、支原来源应清楚，应进行细胞无菌检测、支原体和外原因子等检测；病毒分离不宜使用体和外原因子等检测；病毒分离不宜使用肿瘤原性的细胞系。
6、尽可能使用非肿瘤原肿瘤原性的细胞系。尽可能使用非肿瘤原性细胞，如人二倍体细胞或性细胞，如人二倍体细胞或Vero细胞（非细胞（非洲绿猴肾细胞洲绿猴肾细胞）等。）等。2用动物分离病毒，对所用动物名称、品用动物分离病毒，对所用动物名称、品系、系、级别级别、年龄、接种途径、饲养条件和、年龄、接种途径、饲养条件和制备毒种的动物脏器名称等须详细记载；制备毒种的动物脏器名称等须详细记载；如再适应到细胞，则还应参照上述对分离如再适应到细胞，则还应参照上述对分离用细胞的要求。用细胞的要求。8疫苗临床前研究指导原则l医学实验动物分为四级：医学实验动物分为四级：一级为普通动物；一级为普通动物；二级为清洁动物；二级为
7、清洁动物；三级为无特定三级为无特定病病原体动物；原体动物；四级为无菌动物和悉生动物。四级为无菌动物和悉生动物。9疫苗临床前研究指导原则l普通动物（普通动物（Conventioal animals）是未经）是未经积极的微生物学控制，普遍地饲养在开放积极的微生物学控制，普遍地饲养在开放卫生环境里的动物。垫料和食物不经高压卫生环境里的动物。垫料和食物不经高压消毒，饮水为自来水，不喂青饲料。鼠应消毒，饮水为自来水，不喂青饲料。鼠应排除肺炎病毒，沙门氏菌和链球菌，地鼠排除肺炎病毒，沙门氏菌和链球菌，地鼠不应有蛲虫。普遍动物只能供教养和一般不应有蛲虫。普遍动物只能供教养和一般性实验，不适用于研究实验。性实
8、验，不适用于研究实验。10疫苗临床前研究指导原则l清洁普通动物（清洁普通动物（Clean conventional Clean conventional animal,CCVanimal,CCV）（亦称最低限度疾病动物）（亦称最低限度疾病动物MOAMOA）或称清洁动物（）或称清洁动物（Clean animal,CLClean animal,CL）l来自屏障系统的来自屏障系统的SPFSPF动物，饲养在温湿度动物，饲养在温湿度恒定的普通设施中的动物。垫料、饲料、恒定的普通设施中的动物。垫料、饲料、用具等均应经过高压消毒。空气亦应经用具等均应经过高压消毒。空气亦应经过一定的过滤，工作人员穿干净服装操
9、过一定的过滤，工作人员穿干净服装操作，此类动物的微生物控制标准基本与作，此类动物的微生物控制标准基本与SPFSPF相同，不同之处为血清病毒抗体检查相同，不同之处为血清病毒抗体检查（脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒（脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒）经）经常可检出一定滴度的抗体，但不允许出常可检出一定滴度的抗体，但不允许出现临床症状和脏器的病理变化和自然死现临床症状和脏器的病理变化和自然死亡。亡。11疫苗临床前研究指导原则l无特定病原体动物（无特定病原体动物（Specefic pathogen-Specefic pathogen-free animalsfree animals）是指机体内无特定的微生）是指机体
10、内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，简称物和寄生虫存在的动物，简称SPFSPF动物。动物。但非特定的微生物和寄生虫是允许存在的，但非特定的微生物和寄生虫是允许存在的，实际上就是指无传染病的健康动物。一般实际上就是指无传染病的健康动物。一般大多先培育出无菌动物或悉生动物后，再大多先培育出无菌动物或悉生动物后，再把其转移到有封闭系统（把其转移到有封闭系统（Barrier SystemBarrier System）的设施中饲育繁殖。原则上的设施中饲育繁殖。原则上SPFSPF动物室内动物室内是不允许存在病原菌的，但在封闭系统环是不允许存在病原菌的，但在封闭系统环境中，难免有很多非病原性微生物会逐渐境中
11、，难免有很多非病原性微生物会逐渐进入动物机体内，故亦有人把这个转移过进入动物机体内，故亦有人把这个转移过程称之为通常动物化。程称之为通常动物化。12疫苗临床前研究指导原则l悉生动物（悉生动物（Cnotobiotes animalsCnotobiotes animals）是指）是指机体内带着已知微生物的动物。此种动机体内带着已知微生物的动物。此种动物原是无菌动物，系人为的将指定微生物原是无菌动物，系人为的将指定微生物投给其体内，例如使大肠杆菌定居在物投给其体内，例如使大肠杆菌定居在无菌小鼠体内，在进行微生物检查时，无菌小鼠体内，在进行微生物检查时，仅能检出大肠杆菌。亦有人工投给二种仅能检出大肠杆
12、菌。亦有人工投给二种以上的已知微生物。悉生动物一般分为以上的已知微生物。悉生动物一般分为单菌（单菌（MonoxenieMonoxenie）、双菌（）、双菌（DixenieDixenie）、）、三菌（三菌（TrixenieTrixenie），或多菌（），或多菌（PolyxeniePolyxenie）动物。此种动物同无菌动物一样是放在动物。此种动物同无菌动物一样是放在隔离器内饲育的，但因其带有已知的微隔离器内饲育的，但因其带有已知的微生物，故隔离器内有微生物及其代谢产生物，故隔离器内有微生物及其代谢产物的污染。物的污染。13疫苗临床前研究指导原则l无菌动物（无菌动物（Germ free anima
13、lsGerm free animals）是指机）是指机体内外均无任何寄生物（微生物和寄生虫）体内外均无任何寄生物（微生物和寄生虫）的动物。此种动物在自然界中并不存在，的动物。此种动物在自然界中并不存在，必须用人为的方法培育出来。方法：一般必须用人为的方法培育出来。方法：一般将临产前的健康动物用麻醉药品或颈椎臼将临产前的健康动物用麻醉药品或颈椎臼法处死后，立即浸泡在法处死后，立即浸泡在3737灭菌液中，送灭菌液中，送进无菌室（或无菌隔离器），按无菌手术进无菌室（或无菌隔离器），按无菌手术进行剖腹，切除带胎子宫（子宫内首先应进行剖腹，切除带胎子宫（子宫内首先应无菌），将其浸入消毒液里并输送到另一无
14、菌），将其浸入消毒液里并输送到另一隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布揩拭仔体并断脐（电刀切断）后，放隔离揩拭仔体并断脐（电刀切断）后，放隔离器内人工喂乳或用其它品系的无菌母鼠作器内人工喂乳或用其它品系的无菌母鼠作保姆供养。保姆供养。14疫苗临床前研究指导原则l象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻烦，故象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻烦，故采用保姆代养较为方便。而象豚鼠因在一采用保姆代养较为方便。而象豚鼠因在一定程度上能自力饮乳，故人工哺乳较容易。定程度上能自力饮乳，故人工哺乳较容易。另外，象禽类、鱼类、昆虫类，因是在卵另外，象禽类、鱼类、昆虫类，因是在卵中无菌的前
15、提下进行的，故用药物将卵周中无菌的前提下进行的，故用药物将卵周围灭菌后移入无菌隔离器内使其孵化即可，围灭菌后移入无菌隔离器内使其孵化即可，而且，这些动物一般在在出生后能自力采而且，这些动物一般在在出生后能自力采食，故较易育成。食，故较易育成。15疫苗临床前研究指导原则l3 3确定分离菌株所用培养基名称、种类，确定分离菌株所用培养基名称、种类，以及分离培养的温度和条件。以及分离培养的温度和条件。（三）菌、毒株分离传代特性（三）菌、毒株分离传代特性应包括样品处理方法、首次应包括样品处理方法、首次盲传盲传确证菌毒确证菌毒株阳性代次、菌毒株确证检定方法、每代株阳性代次、菌毒株确证检定方法、每代培养天数
16、、病毒滴度、滴定方法、动物是培养天数、病毒滴度、滴定方法、动物是否发病或死亡等资料。否发病或死亡等资料。16疫苗临床前研究指导原则l盲传：一般是用于分离样本（血清，体盲传：一般是用于分离样本（血清，体液等）中的微生物（主要是细胞内寄生液等）中的微生物（主要是细胞内寄生的，比如病毒）。的，比如病毒）。取一定量的血清，接取一定量的血清，接种某种细胞，培养一定时间（种某种细胞，培养一定时间（7天），无天），无论上清中有没有微生物（如病毒），都论上清中有没有微生物（如病毒），都取该上清，继续接种这种细胞，如此循取该上清，继续接种这种细胞，如此循环几次，就称为盲传几代环几次，就称为盲传几代。17疫苗临床
17、前研究指导原则（四）菌毒种建立和保存（四）菌毒种建立和保存应包括原始菌毒种代次、滴度，添加的应包括原始菌毒种代次、滴度，添加的保护剂的名称和浓度、存储条件等资料；保护剂的名称和浓度、存储条件等资料；原代菌毒种原代菌毒种是指已适应到可生产疫苗的是指已适应到可生产疫苗的细胞或培养基，可稳定传代、保留抗原细胞或培养基，可稳定传代、保留抗原性、并经过检定可用于疫苗生产的菌毒性、并经过检定可用于疫苗生产的菌毒种。种。种子批的建立应符合现行版中国种子批的建立应符合现行版中国药典药典“生物制品制品检定用菌毒种管生物制品制品检定用菌毒种管理规程理规程”的要求，应对种子批进行菌毒的要求，应对种子批进行菌毒种的传
18、代和限定代次的研究，以证明种的传代和限定代次的研究，以证明主主种子批种子批和和工作种子批工作种子批在规定代次内的生在规定代次内的生物学特性与原始菌毒种的一致性。物学特性与原始菌毒种的一致性。18疫苗临床前研究指导原则l原始种子批原始种子批（Primary Seed LotPrimary Seed Lot）：一）：一定数量的已验明其来源、历史和生物学定数量的已验明其来源、历史和生物学特性并经临床研究证明其安全性和免疫特性并经临床研究证明其安全性和免疫原性良好的病毒株（或菌株）或用于制原性良好的病毒株（或菌株）或用于制备原疫苗（备原疫苗（Original VaccineOriginal Vacci
19、ne）的活病）的活病毒（或菌体）悬液。该悬液应加工为单毒（或菌体）悬液。该悬液应加工为单一批，以确保其组成均一，并经充分鉴一批，以确保其组成均一，并经充分鉴定。原始种子批用于制备主种子批。定。原始种子批用于制备主种子批。19疫苗临床前研究指导原则l主种子批主种子批（Master Seed LotMaster Seed Lot）：一定数）：一定数量的来自原始种子批的病毒株（或菌株）量的来自原始种子批的病毒株（或菌株）或用于制备原疫苗（或用于制备原疫苗（Original VaccineOriginal Vaccine）的活病毒（或菌体）悬液。该悬液应加工的活病毒（或菌体）悬液。该悬液应加工为单一批
20、，以确保其组成均一，并经全面为单一批，以确保其组成均一，并经全面鉴定。主种子批用于制备疫苗生产用的工鉴定。主种子批用于制备疫苗生产用的工作种子批。作种子批。20疫苗临床前研究指导原则l原疫苗原疫苗（original Vaccineoriginal Vaccine）：指按生）：指按生产单位技术规范制备的疫苗，在临床试产单位技术规范制备的疫苗，在临床试验中是安全和有免疫原性的。验中是安全和有免疫原性的。工作种子批工作种子批（Working Seed LotWorking Seed Lot）：按）：按国家药品管理当局（国家药品管理当局（NRANRA）批准的方法，）批准的方法，从主种子批传代而得到的活
21、病毒或细菌。从主种子批传代而得到的活病毒或细菌。工作种子批用于生产疫苗。工作种子批用于生产疫苗。21疫苗临床前研究指导原则（五）菌毒种的检定（五）菌毒种的检定1鉴别试验：可采用血清学、生物学、鉴别试验：可采用血清学、生物学、核酸序列分析等方法证明为该菌毒种。核酸序列分析等方法证明为该菌毒种。明确该病原体及其它相关生物分子的基明确该病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、亚型和确其血清型、亚型和/或基因型，对该种或基因型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，
22、基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。和研究。22疫苗临床前研究指导原则2无菌检查：按照现行版中国药典的无菌检查：按照现行版中国药典的要求进行，应符合规定。要求进行，应符合规定。3外源因子外源因子检查：按照现行版中国药典检查：按照现行版中国药典的相关要求进行，应符合规定，取样量的相关要求进行，应符合规定，取样量应足够检测试验的需要。应足够检测试验的需要。4扩增能力和感染性滴度：应能达到按生
23、扩增能力和感染性滴度：应能达到按生产工艺要求顺利生产合格疫苗的要求。产工艺要求顺利生产合格疫苗的要求。应建立测定菌毒种扩增能力和感染性滴应建立测定菌毒种扩增能力和感染性滴度的方法和标准，并提供这些扩增能力度的方法和标准，并提供这些扩增能力和感染性滴度与疫苗有效性之间的相关和感染性滴度与疫苗有效性之间的相关性数据。性数据。23疫苗临床前研究指导原则l外源因子外源因子（Adventitious AgentsAdventitious Agents、Extraneous AgentsExtraneous Agents）：存在于接种物，细）：存在于接种物，细胞基质及（或）生产制品所用的原材料及胞基质及（
24、或）生产制品所用的原材料及制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和外源性病毒。体和外源性病毒。24疫苗临床前研究指导原则5免疫原性检查：菌毒种的免疫原性是免疫原性检查：菌毒种的免疫原性是衡量该疫苗是否有效的重要指标，应制衡量该疫苗是否有效的重要指标，应制定和建立测定菌毒种免疫原性的有效方定和建立测定菌毒种免疫原性的有效方法和标准，以评估该候选菌毒种能否进法和标准，以评估该候选菌毒种能否进行疫苗生产。行疫苗生产。25疫苗临床前研究指导原则6减毒特性减毒特性（1）如研制）如研制减毒活疫苗减毒活疫苗应对原始菌毒株应对原始菌毒株的生物学、血清型、基因型和免疫原性的生
25、物学、血清型、基因型和免疫原性进行研究；减毒方法、减毒过程、减毒进行研究；减毒方法、减毒过程、减毒程度和减毒后的生物学、血清型、基因程度和减毒后的生物学、血清型、基因型和免疫原性，并进行减毒前后的特性型和免疫原性，并进行减毒前后的特性对比，尤其要对减毒后的安全性和免疫对比，尤其要对减毒后的安全性和免疫原性作出确切的结论；原性作出确切的结论；26疫苗临床前研究指导原则l减毒株减毒株（Attenuated StrainsAttenuated Strains）：一种）：一种细菌或病毒，其对特定宿主的毒力已被细菌或病毒，其对特定宿主的毒力已被适当减弱或已消失。适当减弱或已消失。27疫苗临床前研究指导原
26、则（2）应建立减毒特性指标的验证方法、动）应建立减毒特性指标的验证方法、动物模型和减毒后安全性的标准以及检测物模型和减毒后安全性的标准以及检测和警戒毒力回复的依据等；和警戒毒力回复的依据等；（3）对制备注射剂的减毒活疫苗，除一般）对制备注射剂的减毒活疫苗，除一般的外源因子检测外，还应验证无逆转录的外源因子检测外，还应验证无逆转录病毒的污染。该验证方法可采用病毒的污染。该验证方法可采用PERT法法（4）如已知该病毒具有嗜神经毒性，其验）如已知该病毒具有嗜神经毒性，其验证要求可参考证要求可参考IABS Scientific workshop on neurovirulence test for l
27、ive virus vaccines,WHO,31 January 2005。28疫苗临床前研究指导原则三、疫苗的生产工艺研究三、疫苗的生产工艺研究（一）建立菌毒种库（一）建立菌毒种库应建立应建立三级种子库三级种子库。对种子库的遗传稳。对种子库的遗传稳定性进行分析，明确该种子库可以传代定性进行分析，明确该种子库可以传代的次数。生产用菌毒种、细胞和涉及生的次数。生产用菌毒种、细胞和涉及生产的工艺技术应注意专利，应进行相关产的工艺技术应注意专利，应进行相关专利查询。专利查询。29疫苗临床前研究指导原则（二）生产用细胞和（二）生产用细胞和/或培养基或培养基1生产用细胞应符合现行版中国药典生产用细胞应
28、符合现行版中国药典中中“生物制品生产用动物细胞基质制备生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程及检定规程”的要求，如用传代细胞系的要求，如用传代细胞系应建立应建立三级细胞库三级细胞库。2生产用培养基尽可能避免使用动物来生产用培养基尽可能避免使用动物来源和可能引起人体不良反应的原材料，源和可能引起人体不良反应的原材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性原材禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性原材料。料。30疫苗临床前研究指导原则l原始细胞库原始细胞库（Primary Cell BankPrimary Cell Bank，PCBPCB）：）：一定量经过充分鉴定的人、动物或其他来一定量经过充分鉴定的人、动物或
29、其他来源的细胞；源自单一组织或细胞分装于容源的细胞；源自单一组织或细胞分装于容器内，组成应均一，冻存于器内，组成应均一，冻存于-13O-13O或以下，或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于制备其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于制备主细胞库（主细胞库（Master Cell BankMaster Cell Bank，MCBMCB）。）。31疫苗临床前研究指导原则l主细胞库主细胞库（Master Cell BankMaster Cell Bank，MCBMCB）：）：经过充分鉴定一定量的人、动物或其他经过充分鉴定一定量的人、动物或其他来源且保存适宜的细胞，一般是由原始来源且保存适宜的细胞，一般是由
30、原始细胞库（细胞库（Primry Cell BankPrimry Cell Bank）的细胞制）的细胞制备而成，分装于容器内，组成应均一，备而成，分装于容器内，组成应均一，保存于保存于-13O-13O或以下，通常用于制备工或以下，通常用于制备工作细胞库（作细胞库（Working Cell BankWorking Cell Bank，WCBWCB）。）。32疫苗临床前研究指导原则l工作细胞库工作细胞库（Working Cell BankWorking Cell Bank，WCBWCB）：）：由有限传代水平的主细胞库制备而来的均由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容
31、器一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，适当保存，常冻存于中，适当保存，常冻存于-13O-13O或以下，或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于生产。其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于生产。所有容器处理相同，其中一支（瓶）或多所有容器处理相同，其中一支（瓶）或多支（瓶）一旦由贮存库中移出后，不得返支（瓶）一旦由贮存库中移出后，不得返回原种子贮存库中。实际上，细胞种子是回原种子贮存库中。实际上，细胞种子是通过亚培养扩增至一定代次（或适宜的群通过亚培养扩增至一定代次（或适宜的群体倍增数）后，由制造单位选定并由国家体倍增数）后，由制造单位选定并由国家药品管理当局批准。此细胞合并后分装于药品管理当局批
32、准。此细胞合并后分装于安瓿，并低温保存为安瓿，并低温保存为WCBWCB。33疫苗临床前研究指导原则（三）疫苗原液生产工艺的研究（三）疫苗原液生产工艺的研究1生产工艺的主要技术参数的确定生产工艺的主要技术参数的确定（1）病毒与细胞的接种比例、）病毒与细胞的接种比例、病毒感染病毒感染复数复数（MOI：multiplicity of infection，含义是感染时病毒与细胞数量的比值含义是感染时病毒与细胞数量的比值）的最佳参数、细胞培养和病毒培养的最的最佳参数、细胞培养和病毒培养的最佳温度、培养时间和收获时间。菌毒种佳温度、培养时间和收获时间。菌毒种的接种量，培养和发酵条件等技术参数的接种量，培养
33、和发酵条件等技术参数的研究确定；的研究确定；34疫苗临床前研究指导原则（2）灭活剂灭活剂的选择和依据；的选择和依据；（3）灭活或裂解条件及灭活或脱毒效果的）灭活或裂解条件及灭活或脱毒效果的验证，灭活效果验证的依据、方法；灭验证，灭活效果验证的依据、方法；灭活效果的验证，应采用尽可能敏感的细活效果的验证，应采用尽可能敏感的细胞或培养基和方法进行；胞或培养基和方法进行；35疫苗临床前研究指导原则l灭活灭活是指破坏病原体的生物学特性，但是指破坏病原体的生物学特性，但尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清中补体活性的过程。常用的灭活剂有甲中补体活性的过程。常用的灭活剂有甲
34、醛、醛、-丙内酯丙内酯(BPL)(BPL)或其他有效灭活剂。或其他有效灭活剂。36疫苗临床前研究指导原则l甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基，又既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基，又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活；用甲醛灭活时间长，一般有病原体存活；用甲醛灭
35、活时间长，一般需要在需要在37-3937-39处理处理24h24h以上或更长时间。以上或更长时间。并且灭活的效果易受温度、并且灭活的效果易受温度、pHpH、浓度、是、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，在研究中应引起注意；残留的因素影响，在研究中应引起注意；残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生制激性反应。制激性反应。37疫苗临床前研究指导原则l-丙内酯丙内酯(BPL)(BPL)在国外已广泛用于各种在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。它是一种杂环类化合物疫苗的灭活。它是一种杂环类化合物(C(C3 3H H
36、4 4O O2 2)，沸点，沸点155155，常温下是无色粘，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用。稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用。它作用于病原体它作用于病原体DNADNA或或RNARNA，改变病毒核，改变病毒核酸结构达到灭活目的，而不直接作用于酸结构达到灭活目的，而不直接作用于蛋白。蛋白。38疫苗临床前研究指导原则（4）原液原液的浓缩和的浓缩和/或活性抗原的提取纯或活性抗原的提取纯化等工艺研究：纯化和提取工艺中各种化等工艺研究：纯化和提取工艺中各种条件进行优化，纯化和提取工艺对抗原条件进行优化，纯化和提取工艺对抗原活性成分是否影响，应建立稳定的纯化活性成分是否影响，应建立稳定
37、的纯化工艺，包括纯化时的回收率、抗原活性工艺，包括纯化时的回收率、抗原活性和纯度等的稳定性；并制定相应的质控和纯度等的稳定性；并制定相应的质控指标和检测方法，按指标和检测方法，按GMP要求在符合要求在符合GMP要求的生产环境下生产；要求的生产环境下生产；（5）初步确定起始投料、原液、半成品）初步确定起始投料、原液、半成品和成品的产出比的理论数据。和成品的产出比的理论数据。39疫苗临床前研究指导原则l原液原液（Bulk）：系指用于制造最终配制物）：系指用于制造最终配制物（Final formulation）或半成品）或半成品（Final Bulk）的均一物质。由一次或多）的均一物质。由一次或多次
38、单一收获物而得到，一般需要纯化并可次单一收获物而得到，一般需要纯化并可能配制一批或多批半成品。如属微生物，能配制一批或多批半成品。如属微生物，通常视为原悬液（通常视为原悬液（Bulk Suspension）。如）。如原液已浓缩，经稀释成为半成品。对于多原液已浓缩，经稀释成为半成品。对于多价制品（如三价脊灰疫苗），原液是由单价制品（如三价脊灰疫苗），原液是由单价原液配制而成。价原液配制而成。40疫苗临床前研究指导原则l2疫苗对佐剂的要求疫苗对佐剂的要求目前能用于疫苗的佐剂多为氢氧化铝，目前能用于疫苗的佐剂多为氢氧化铝，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，且增加注射
39、局部的副反应几率。如疫苗且增加注射局部的副反应几率。如疫苗的抗原能满足免疫的需要，则不加佐剂的抗原能满足免疫的需要，则不加佐剂为宜。为宜。l佐剂佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。型。41疫苗临床前研究指导原则l如果在终制品中使用佐剂，则对以下问题如果在终制品中使用佐剂，则对以下问题应进行研究，对于已经明确有佐剂效应或应进行研究，对于已经明确有佐剂效应或者已经商品化的佐剂，只需提供该类制剂者已经商品化的佐剂，只需提供该类制剂的组
40、分或化学组成，国内外使用该类制剂的组分或化学组成，国内外使用该类制剂的情况，无需再进行毒理和安全性研究。的情况，无需再进行毒理和安全性研究。若国内外均未使用过该类佐剂若国内外均未使用过该类佐剂,则必须对其则必须对其作用原理、安全性及佐剂效应进行详细的作用原理、安全性及佐剂效应进行详细的研究并建立切实可行的评价方法。研究并建立切实可行的评价方法。43疫苗临床前研究指导原则（四）疫苗的配方研究（四）疫苗的配方研究应对疫苗的配方进行研究，如疫苗中添应对疫苗的配方进行研究，如疫苗中添加的稳定剂成分，缓冲液、佐剂、以及加的稳定剂成分，缓冲液、佐剂、以及冻干疫苗的赋形剂成分等是否对疫苗造冻干疫苗的赋形剂成
41、分等是否对疫苗造成影响。成影响。44疫苗临床前研究指导原则四、药理、毒理和生物分布四、药理、毒理和生物分布疫苗不同于一般的化学药品，药理、毒疫苗不同于一般的化学药品，药理、毒理的实验要求具有特殊性，因此，该制理的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学试验主要包括发生作用的原品的药理学试验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位和全身的病理反方面主要考虑接种部位和全身的病理反应、以及机体对该疫苗的非期望的免疫应、以及机体对该疫苗的非期望的免疫应答反应和这种反应
42、的持续时间。由于应答反应和这种反应的持续时间。由于以上各方面是互相关联的，因此，应综以上各方面是互相关联的，因此，应综合考虑药理、毒理和免疫原性或生物效合考虑药理、毒理和免疫原性或生物效价的因素。价的因素。45疫苗临床前研究指导原则 应建立适当的试验及检测方法来评价疫应建立适当的试验及检测方法来评价疫苗的免疫原性或生物效价，如果有动物苗的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型的，可以采用动模型或可建立动物模型的，可以采用动物模型直接评价疫苗的生物效价，如：物模型直接评价疫苗的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病原体的攻击实验来评价
43、该疫苗的采用病原体的攻击实验来评价该疫苗的保护效果。而且要建立剂量与生物效价保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。若无法建立动物模型，应建立能途径。若无法建立动物模型，应建立能验证该疫苗有效性的体外实验进行评价。验证该疫苗有效性的体外实验进行评价。46疫苗临床前研究指导原则l灭活疫苗的生物分布较难检测和评价。灭活疫苗的生物分布较难检测和评价。减毒活疫苗的生物分布应建立敏感的动减毒活疫苗的生物分布应建立敏感的动物模型，可测定接种疫苗后的病毒血症物模型，可测定接种疫苗后的病毒血症（或菌血症）以及持续时间，排毒（菌）（或菌血症）以
44、及持续时间，排毒（菌）方式和途径，对是否呈现体内复制及感方式和途径，对是否呈现体内复制及感染的器官组织细胞应进行详细的研究。染的器官组织细胞应进行详细的研究。47疫苗临床前研究指导原则l五、质量控制及检定的要求五、质量控制及检定的要求（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行,保证产品的质量、工艺的稳定性。保证产品的质量、工艺的稳定性。（二）产品的质量检定与要求（二）产品的质量检定与要求1外观检查：根据样品
45、的特征建立外观的外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准。质量标准。48疫苗临床前研究指导原则2pH值检测：可根据一般生物制品的要值检测：可根据一般生物制品的要求建立标准，一般为求建立标准，一般为7.20.5。3纯度：主要用于评价纯化制品中含有有纯度：主要用于评价纯化制品中含有有效成分的量和杂质的最低限量，制定相效成分的量和杂质的最低限量，制定相应标准，通常可测定有效抗原在疫苗中应标准，通常可测定有效抗原在疫苗中的绝对值或测定主要杂质的量推算有效的绝对值或测定主要杂质的量推算有效抗原在疫苗中的相对值。抗原在疫苗中的相对值。49疫苗临床前研究指导原则4宿主细胞宿主细胞 DNA和蛋白残留量检测：
46、和蛋白残留量检测：采用传代细胞生产疫苗，应限制疫苗中采用传代细胞生产疫苗，应限制疫苗中的宿主细胞的宿主细胞DNA和蛋白残留量，进行方和蛋白残留量，进行方法研究时应建立相应的标准品，并对检法研究时应建立相应的标准品，并对检测试剂的敏感性和特异性进行验证。疫测试剂的敏感性和特异性进行验证。疫苗中残余宿主细胞苗中残余宿主细胞DNA及蛋白残留量可及蛋白残留量可参考现行版中国药典的相关要求。参考现行版中国药典的相关要求。50疫苗临床前研究指导原则5.无菌检查：应符合现行版中国药典无菌检查：应符合现行版中国药典的相关要求。的相关要求。6.热原或细菌内毒素检查：可参照现行版热原或细菌内毒素检查：可参照现行版
47、中国药典的相关要求进行；中国药典的相关要求进行；也可以也可以用其它方法检测疫苗中的热原物质。用其它方法检测疫苗中的热原物质。7.抗生素检测：预防用疫苗在生产过程中抗生素检测：预防用疫苗在生产过程中不得添加青霉素或其他不得添加青霉素或其他-内酰氨类抗生内酰氨类抗生素；如在生产过程中添加除上述以外的素；如在生产过程中添加除上述以外的其他抗生素，应建立相应的检测方法并其他抗生素，应建立相应的检测方法并规定抗生素残留量的要求。规定抗生素残留量的要求。51疫苗临床前研究指导原则8.灭活效果的验证：由于制备疫苗的病原体灭活效果的验证：由于制备疫苗的病原体一般均对人类致病，因此应建立有效的灭一般均对人类致病
48、，因此应建立有效的灭活方法对该制品中的病原体进行灭活，并活方法对该制品中的病原体进行灭活，并应对灭活效果进行验证；在成品检定中应应对灭活效果进行验证；在成品检定中应建立灭活剂残留量检测的方法和限度标准。建立灭活剂残留量检测的方法和限度标准。9.异常毒性检查：应符合现行版中国药典异常毒性检查：应符合现行版中国药典的相关要求。的相关要求。52疫苗临床前研究指导原则10.稳定性试验：是指疫苗在常规保存温度稳定性试验：是指疫苗在常规保存温度下的稳定性试验。由于稳定性试验的结下的稳定性试验。由于稳定性试验的结果直接与制品的效期有关，且试验观察果直接与制品的效期有关，且试验观察时间较长，因此应在生产工艺确
49、定后尽时间较长，因此应在生产工艺确定后尽早留样进行，定期取样测定制品效力和早留样进行，定期取样测定制品效力和其他相关的质量指标；对稳定性试验结其他相关的质量指标；对稳定性试验结果与加速稳定性试验数据进行分析对比，果与加速稳定性试验数据进行分析对比，可为正式产品的有效期确定提供依据。可为正式产品的有效期确定提供依据。53疫苗临床前研究指导原则11.效力试验（生物效价）：由于用于预防效力试验（生物效价）：由于用于预防的疫苗是通过机体的免疫应答反应发生作的疫苗是通过机体的免疫应答反应发生作用的，因此应评价其体液免疫和细胞免疫用的，因此应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应的生
50、物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠可以计算小鼠ED5050以及抗体产生的滴度，以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的性质进行评价，如亚量的方法，对抗体的性质进行评价，如亚型测定及抗原中和位点分析等；型测定及抗原中和位点分析等；54疫苗临床前研究指导原则 在评价细胞免疫效价时，应当建立检测在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法，也可通过对细胞评价细胞免疫的
