1、糖尿病动物模型综述糖尿病动物模型综述13级民族药物化学级民族药物化学 李波李波 糖尿病(diabetesmellitus,DM)属中医学消渴范畴,是以多饮、多食、多尿、身体消瘦,或尿浊、尿有甜味为特征的疾病。现代医学认为,糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病,是由于体内胰岛素缺乏,或拮抗胰岛素的激素增高,或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征。临床上分为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)即1型和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)即2型两种类型。为探清糖尿病病因,建立理想的DM动物模型是十分必要的,动物模型也可以筛选降糖药物,可以为中医药治疗糖尿病提供
2、实验依据。人类疾病的动物模型(animal model of human disease)是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。原则：相似性，重复性，可靠性，适用性和可控性，易行性和经济性。注意事项：（1）注意模型要尽可能再现所要求的人类疾病；（2）注意所选用动物的实用价值；（3）注意环境因素对模型动物的影响；(4)不能盲目地使用近交系动物,不然会导致不能控制的因素进入实验；（5）动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度；（6）正确地评估动物疾病模型。目前,DM动物模型主要分为3类:药物诱发性DM动物模型、自发遗传性DM动物模型和转基因DM动物模型。化学药物诱
3、导法是指运用化学药物损伤胰岛B细胞导致胰岛素缺乏而引起实验性糖尿病,是应用于药理学研究的经典方法。化学药物诱导的糖尿病具有发病率高、造模时间短、发病时间整齐和病情的严重程度较统一等优点,常用的药物有四氧嘧啶和链脲佐菌素。四氧嘧啶(Alloxan)是一种特异的胰岛细胞毒剂,可选择性地损伤多种动物的胰岛B细胞,引起实验性糖尿病。它常用于制备1型糖尿病动物模型。造模方法：给动物一次性静脉或腹腔注射1%5%的Alloxan水溶液100200 mg/kg。机制：Alloxan是自由基活性剂,其所产生的H2O2等负离子自由基能选择性地直接损伤胰腺细胞的DNA,引起胰腺细胞的死亡,胰岛素合成受阻,引起高血糖
4、。优点：用药量少,操作方法简便且价廉。由血浆半衰期仅12 min,故能快速成模,且注射速度越快成模率越高。缺点：大剂量的Alloxan可致动物酮症酸中毒而死亡,可致肝、肾组织中毒性损害。因此,使用Alloxan制备糖尿病模型时要严格控制剂量。注意事项：Alloxan水溶后不稳定,应现用现配。STZ是一种药效强大的烷化剂,能干扰葡萄糖的转运,影响葡萄糖激酶的功能,诱导DNA双链的断裂。造模方法：(1)迟发型:大鼠第1天腹腔注射福氏佐剂015 mL,次日按25 mg/kg腹腔注射STZ溶液,每周1次,连续3周。此模型接近人类1型糖尿病。(2)速发型:动物喂以高糖高脂饲料12个月，诱导出胰岛素抵抗后
5、,按2530 mg/kg腹腔注射STZ,一周后断尾取血测空腹血糖或口服葡萄糖耐量试验。给糖调节受损动物,继续饲高糖高脂饲料可出现高血糖症、尿酮尿酸症和/三多一少症状,进而发生白内障、糖尿病性心脏病、糖尿病性肾病等并发症。此模型适用于人类2型糖尿病的研究。机制：STZ引起糖尿病的机制可能通过以下途径。（1)STZ直接破坏胰岛细胞:首先将其DNA碱基上的特殊位点烷基化后,进一步作用于ADP核糖体合成酶。从而损伤胰岛细胞,使细胞数量明显减少,残存的细胞几乎完全脱颗粒,胰岛素合成和分泌减少,引起糖代谢紊乱致血糖升高。(2)通过NO和自由基途径损伤胰岛细胞:STZ是一种含亚硝基的化合物,可以诱导NO的合
6、成,增加对胰岛细胞的氧化侵袭而特异性破坏胰岛细胞。优点：STZ对组织毒性小,诱发动物糖尿病模型成功率高,且一般不表现自发性缓解。缺点：STZ剂量过大易导致动物死亡。因多尿,高糖,体重明显减轻,故体重较轻的动物易死亡。注意：利用STZ造模时应控制剂量。STZ必须4 保存及新鲜配制。造模方法:Alloxan和STZ用50 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH=415)分别配成200 mg/mL和120 mg/ml的溶液。实验动物禁食24 h后,氯胺酮麻醉下行股静脉穿刺,留置导管,经导管分别注入上述 浓度的Alloxan 50 mg/kg和STZ 30 mg/kg。给药后24h血糖升高,48 h后血
7、糖 11.1mmol/L且持续两周维持在此高血糖水平。机制:Alloxan和STZ都能通过其毒性作用选择性破坏胰岛细胞,使胰岛素分泌减少,从而诱导实验动物的糖尿病状态。优点:两药合用,减少二者剂量,既降低了由于单用Alloxan对肝、肾的损害,又弥补了单用STZ剂量过大而致动物死亡或剂量过小而致成模率低的不足。注意事项:两药诱导后10 h左右可出现急性低血糖反应,故给药后应在第8,10,13 h经皮下注射补充一定量的葡萄糖,以预防发生致命的低血糖。造模方法:小鼠皮下注射AD 240ug/kg,给药后135 min从小鼠眼底静脉丛取血测血糖。如未完全出现高血糖,应追加注射1次AD,直到出现糖尿病
8、症状。机制:AD进入体内促进肝脏及肌肉糖原分解,肌肉中糖酵解生成的乳酸增多,经三羧酸循环糖异生增快。同时激活丙酮酸羧化酶,使丙酮酸向磷酸烯醇式丙酮酸转化促进糖异生,导致血糖升高。优点:使用肾上腺素建立模型简单、易行,灵敏度高。缺点:AD造模所测定的血糖不完全是葡萄糖,专一性不强。除AD外，地塞米松2 mg/kg连续肌肉注射可以造成小鼠葡萄糖耐量下降模型。自发性糖尿病动物模型是在自然条件下动物自然产生,或由于基因突变而出现类似人类糖尿病表现的动物模型。实验动物未经任何有意识的人工处理，在自然状态下发生的以高血糖、胰岛素抵抗为主要特征的动物模型。该模型更接近人类糖尿病的自然起病及发展,尤其适于研究
9、糖尿病的病因学。但自发性糖尿病动物因其来源相对较少,饲养、繁殖条件要求高,动物昂贵等缺点限制了其在科学研究中的应用和普及。目前,人们筛选成功并能够作为种系保存下来的自发性的糖尿病动物模型主要是啮齿类动物糖尿病模型。大多数自发性的糖尿病模型为基因缺陷型 或易感型自发糖尿病鼠,但最终发展为1型糖尿病。主要包括有,Diabetes(DB)小鼠、Obese(OB)小鼠、Toronto-KK(T-KK)小鼠、Nagoya Shibata Yasuda(NSY)小鼠;Biobreeding(BB)大鼠、ZuckerDiabetes Fatty(ZDF)大鼠、Goto-Kakizaki(GK)大鼠、Otsu
10、ka Long-EvansTokushima Fatty(OLETF)糖尿病大鼠等。KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型2型糖尿病动物。后与C57BL/6J小鼠杂交,并进行近亲繁殖,得Toronto-(T-kk)小鼠。将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠,得KK-Ay鼠,与KK小鼠相比,有明显的肥胖和糖尿病症状。从5周龄起,血糖、血循环中的胰岛素水平以及HbA1c水平逐步升高。细胞有脱颗粒和糖原浸润,随后出现胰岛肥大和中心气泡。肝脂肪化和脂肪组织增多。脂肪组织的胰岛素敏感性降低比KK小鼠明显,且到16周龄时完全丧失。肾脏病变发生早,发展迅速,肾小球基底膜增厚。用KK-Ay鼠可评价抗糖尿病药物
11、的胰腺外作用。uNOD小鼠(nonobese diabetes mouse)是JCLICR品系小鼠衍生的CTS(白内障易感亚系)糖尿病小鼠近亲杂交而来,其发病多突然,表现明显多饮、多尿、消瘦,血糖显著升高,不用岛素治疗,动物存活不了一个月,通常死于酮血症。NOD小鼠是自发性自身免疫I型糖尿病的一个很好的模型,是由T-细胞(包括CD4和CD8细胞)介导的,其发展受控于一系列T细胞的调节。细胞损伤继发于自身免疫过程,引起低胰岛素血症。免疫调节剂,可溶性白介素-1受体,可溶性TNF受体p55,高果糖饮食等可预防NOD小鼠糖尿病发作。NOD小鼠的糖尿病发病率与性别有关,雌性鼠发病率显著高于雄性鼠,且发
12、病早。NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠是一近交系自发性糖尿病模型,是从远交JCL-ICR小鼠中选择糖耐量异常株培育而成的。其糖尿病发生具有年龄依赖性。24周龄时胰岛素分泌功能严重受损,48周的累积发病率雄性为98%,雌性为31%。此鼠在任何年龄阶段都不表现严重肥胖和显著的高胰岛素血症,胰岛也无肿大或炎性变化。胰岛细胞分泌胰岛素功能受损和胰岛素抵抗可能是NSY小鼠发生NIDDM的机制,与人的NIDDM发病机理相似。是从Wistar大鼠中筛选出来的一种自发性,遗传性1型糖尿病动物模型。其发病和自身免疫性毁坏胰腺细胞引发胰腺炎及胰岛素缺乏有关。大鼠糖尿病发作是突然的,大约在6
13、0120日龄时发病,数天后,糖尿病动物出现严重的高血糖,低胰岛素和酮血症。免疫抑制剂,将新生鼠胸腺切除等可预防糖尿病的发生,说明自身免疫参与发病。中国地鼠(Chinese hamster)亦称黑线仓鼠。其自发性遗传性糖尿病史最早由美国的 Meier 和 Yer-ganign 将健康中国地鼠通过近亲繁殖而成的近交系品种，为非肥胖型，轻、中度高血糖，初发病时，酮尿症发生率、血糖、血浆胰岛素，胰高血糖素和葡萄糖水解酶水平恒定降低而胰高血糖素恒定升高，类似于人类型糖尿病。自发性 NIDDM 近交系中国地鼠(KDS)是日本东京医科大学动物实验中心培育糖尿病模型动物，其 NIDDM 主要发生于雄性地鼠，发
14、病突然，2 月龄发病率为 50%，6 月龄发病率达80%以上。临床表现为多食、多饮、多尿、血糖和糖尿浓度急剧上升，但在无外源性胰岛素治疗条件下仍能存活。并且其心、肾慢性血管病变的病理学特征也与人类糖尿病慢性血管病变相似，因此中国地鼠自发性糖尿病可作为研究型糖尿病及其并发症的良好的动物模型。NIDDM猫科动物与人类NIDDM的临床症状有80%的相似,显著的特征是也好发于中老年阶段,其胰岛素抵抗和肥胖作为糖尿病发生的早期症状。自发的猪NIDDM模型,主要有2个品种,尤卡坦小型猪和哥廷根小型猪。其中尤卡坦小型猪的一种品系表现为糖耐量增高,另一品系则表现为糖耐量受损。哥廷根小型猪给予高脂高能食物后,成
15、为代谢综合征的理想模型。所有种类的动物模型中,在非人灵长类动物模型中所观察到的血糖规律、病理特征与在人类糖尿病患者中所观察到的临床特征最为相似。自发性的糖尿病在食蟹猴、恒河猴、冠毛猴、台湾猴、豚尾猴、西伯里斯岛猴、非洲绿猴以及狒狒等非人灵长类动物中均有发现和报道。转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的生物高新技术,对生命科学的发展起到了重大的推动作用。总的来说,有两种方法：(1)传统的转基因方法,即新基因信息的转入和在动物体内的表达。(2)基因打靶方法,即将特定的内源性基因断裂或以其他基因代替。转基因技术是指研究者按照自己的意愿,借助于实验手段来控制实验动物的特定基因组及其表达等,使动物
16、表现特有的遗传性状;转基因动物模型采用的哺乳动物和人的基因组有很大的同源性,但来源于人的外源蛋白在动物体内由于作用环境的差异,可能会造成功能的差异而导致没有出现相应的模型性。基因敲除是利用基因同源重组原理,采用突变的外源DNA片段整合入受体细胞的DNA同源序列中取代某一特定基因,从而获得基因型发生改变的转基因动物,以研究靶基因的体内功能或相关疾病的致病机制,为研究单个蛋白在胰岛素信号传导中的作用提供了重要手段,同时显示了胰岛素分泌作用的轻微缺陷也能导致糖尿病;但很难揭示胰岛素抵抗和糖尿病发生的根本机制。常见的转基因或基因敲除动物包括与胰岛素和胰岛素受体以及胰岛素下游信号元件相关基因，如:IRS
17、 1、IRS2、GLUT4、PTP 1B等基因敲除小鼠;PPAR组织特定基因敲除小鼠;葡萄糖激酶(GK)或 GLTU2基因敲除小鼠;肝脏特异性胰岛素受体基因敲除小鼠(iL-IRKO);细胞特定基因敲除小鼠;sqstm1 基因敲除(OK)小鼠;骨骼肌特异性 LPL(SMLPL(/)基因敲除小鼠;IRS1/IRS2 双基因敲除小鼠;IRS1+/GK+/双基因敲除小鼠;人胰岛淀粉样蛋白多肽过度表达大鼠;GIPR(dn)转基因小鼠;下丘脑脑源性神经营养因子(BDNF)转基因小鼠模型等。2型糖尿病有两个主要特征:周围胰岛素抵抗和细胞分泌胰岛素功能受损。轻度胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能轻度缺陷的小鼠,杂交后
18、后代可产生2型糖尿病症状。GK/IRS-1双基因剔除小鼠:IRS-1-/-小鼠表现为胰岛素抵抗,但由于B细胞代偿性增生,胰岛素分泌增多,糖耐量正常。细胞特异GK表达降低的小鼠,显示轻度糖耐量异常。两者杂交产生的GK/IRS-1双基因剔除小鼠,表现2型糖尿病症状,既有胰岛素抵抗又有糖耐量异常。医学定义：胰岛素抵抗(Insulin Resistance(Insulin Resistance，IR)IR)指的是正常量的胰岛素起不到正常的降低血糖的作用，体内组织对于胰岛素的作用不敏感。糖耐量：通俗地说就是人体对葡萄糖的耐受能力。妊娠期胰岛素抵抗可引起妊娠糖尿病,患者胎儿典型特征是巨大,而成年后患肥胖和
19、2型糖尿病的概率上升。杂合体Leptin受体缺乏(Leprdb+)小鼠发生GDM症状,其子代特征与GDM母亲所生胎儿症状相似。杂合体C57BL KsJ-db+小鼠也发生GDM,妊娠引起PI3K与IRS-1解离,与IR结合活性增加,胰岛素介导的精氨酸磷酸化增多而IRS-1表达及其酪氨酸磷酸化减少从而使IRS-1结合及激活PI3K能力下降,胰岛素功能不能发挥,出现胰岛素抵抗。4.1 胰腺切除法造糖尿病动物模型 此法是最早的糖尿病动物模型复制方法,1890年Mehring和Minkowski报道,在切除狗的胰腺后,狗会出现多尿、多饮、多食和严重的糖尿现象。实验一般选用较大的动物,如狗和家兔等,其次用
20、大鼠。切除实验动物的全部胰腺,可制成无胰性糖尿病动物模型,需补充外源性胰酶。如果希望动物保持良好的健康状况,需保留部分胰腺组织。艾昭东等在无菌操作下切除实验动物胰腺组织90%左右喂养一段时间后,可成为1型糖尿病模型,胰腺切除90%92.3%的动物比文献报道切除70%90%的动物成模时间更短、更稳定,具有手术并发症较少、动物成活率高、术后动物残存胰腺具有一定外分泌功能、喂养比较容易等优点。高能饮食，主要是脂肪和(或)糖类物质含量较高的食物。有研究表明，高能饮食可使动物细胞过度增殖，因此产生的肥又能进一步引起胰岛素抵抗和糖尿病，于是有研究者采用高脂肪饮食诱导条件下具有发展为非胰岛素依赖型糖尿病遗传
21、倾向的 C57BL/6J 小鼠以及 C57BL/6 和 DBA/2F代杂合子 BDF1 小鼠的方法建立胰岛素抵抗型糖尿病模型。高能饮食诱导建立的 2 型糖尿病模型有具有类似人类 2 型糖尿病发病病因的优势，既能较好的表现出与人类相似的发病症状，又不会因化学试剂诱导而导致体内重要器官受损，被广泛用于多种病因病理，特别是因营养过剩导致的 2 型糖尿病相关的研究工作中。某些病毒（如鼠脑炎病毒M型变异、柯萨奇病毒)可诱发若干品系的成年小鼠胰岛细胞脱颗粒、坏死，导致胰岛细胞破坏，表现出糖尿病的症状，可得到1型糖尿病模型。黄红兰等用柯萨奇B4病毒诱导实验性糖尿病小鼠模型，同时研究模型小鼠在病毒病毒感染后血清一氧化氮浓度的变化以及在不同时期产生的白细胞介素1（IL-1）水平，发现一氧化氮可能参与柯萨奇B4病毒诱导的1型糖尿病发生发展过程。用电凝法或注射金硫葡萄糖选择性破坏下丘脑腹内侧核的饱食中枢，使动物产生贪食，催肥动物，继之发生高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗，近似人的2型糖尿病。谭正怀等给20 24 g 的雌性小鼠用金硫葡萄糖800mg/kg一次腹腔注射诱导肥胖动物模型，造模小鼠体质量明显增加，出现胰岛素抵抗和血糖升高。
