1、实验八实验八-九九 水中细菌总数与大肠菌群数水中细菌总数与大肠菌群数的测定及计数的测定及计数 1、学习检测水中细菌总数和大肠菌群数的方法 2、掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法 3、学习使用大肠菌群检索表实验原理实验原理我国饮用水卫生标准：每ml水样细菌总数37培养24h不得大于100个。水中细菌总数说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大；采用平板菌落计数法测定水中细菌总数。采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，能使大多数细菌生长。总大肠菌群指数高，表示水被粪便污染。采用多管发酵法：初发酵、平板分离和复发酵。我国饮用水卫生标准：每升水中总大肠菌群37培养48h小于3个。发酵管内装有
2、乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一杜氏发酵小管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂,细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。产气情况可通过倒置小管中的气泡来观察。实验材料实验材料实验方法实验方法1.稀释水样：取3支无菌管，分别加入无菌水9ml。取1ml水样加入第一支管中，振荡，混匀，此为10-1。依次做1：10系列稀释至10-2、10-3。2.自不同稀释度的试管中各取0.1ml水，分别加入牛肉膏蛋白胨琼脂平板中，用无菌涂布棒在培养基表面将水涂布均匀，室温
3、下静置10min。每一稀释度作2个平板3.将平板倒置，37，培养24h后，进行菌落计数。污水中细菌总数的检测实验方法实验方法4.菌落计数：CFU/ml某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 例次例次不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释度两个稀释度菌落之比菌落之比菌落总数菌落总数（CFU/ml）10-110-210-3仅有一个稀释度在此范围：菌落数稀释倍数1365164201.6104有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比2，选较小值3890271602.22.7104所有稀释度均300 取稀释倍数最大者无法计数16505135.1105
4、所有稀释度均30 取稀释倍数最小者271152.7102没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者无法计数305123.1104细菌总数实验结果稀释度10-110-210-3平板121212菌落数平均菌落数计算方法细菌总数实验方法实验方法1.稀释水样：取 1ml水样加入9ml无菌水，振荡，混匀，此为10-1。同法稀释至10-2。2.初发酵：分别取1ml10-2、10-1的稀释水样和1ml原水样，各注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨 发酵管中。另取10ml原水样，注入装有5ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。混匀，37 培养24h，24h未产气继续培养至48h。普通浓度发酵管中加入普通浓度
5、发酵管中加入20%20%乳糖乳糖0.55ml0.55ml，3 3倍浓缩发酵管中加倍浓缩发酵管中加入乳糖入乳糖0.75ml0.75ml 多管发酵法测定水中总大肠菌群实验方法实验方法3.平板分离：（1）制备伊红美蓝平板：45，无菌，倾注15ml（2）选产酸产气的发酵管，接种至伊红美蓝平板（分区划线法）（3）培养：37，24h 多管发酵法测定水中总大肠菌群实验方法实验方法分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环实验方法 操作要点操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动平板分离（4）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （5）革兰染色、镜检：选特征菌落实验方法实验方法4.复发酵：（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个 （2）接种至7ml乳糖蛋白胨培养液(加入加入0.35ml0.35ml乳糖液）乳糖液）（3）培养：37，24h （4）观察指标：产酸，产气将结果查阅大肠菌群检数表-6，即可获得每升水样中的总大肠菌群数 多管发酵法测定水中总大肠菌群复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生
