1、第一节 概述 1890年年Behring和北里柴三郎发现和北里柴三郎发现白喉抗毒素白喉抗毒素,建立了血清疗法建立了血清疗法,开创了开创了抗体制药。抗体制药。1937年年Tiselius用电泳法将血清蛋用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、白分离为白蛋白、球蛋白，并球蛋白，并证明抗体活性主要存在于证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。球蛋白组分。抗体制药 抗体抗体是指能与相应抗是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。能的球蛋白。抗体的产生抗体的产生：机体免：机体免疫系统受抗原刺激后，疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合化为浆
2、细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。成和分泌的球蛋白。抗体制药抗体攻击病毒凝集细菌 免疫球蛋白的发现 20 20世纪世纪6060年代发现多发性骨髓瘤是浆年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现清中出现同抗体结构类似同抗体结构类似的球蛋白，统称的球蛋白，统称为为免疫球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。）。所以所以Ig是化学结构的概念，而是化学结构的概念，而抗体抗体是生物是生物学功能的概念。所有抗体是学功能的概念。所有抗体是Ig，但并非所，但并非所有有Ig分子都有抗体活性。分子都有抗体活性。抗体制药注射抗原注射抗原
3、IgM IgG（10d，IgM）抗体制药初级免疫反应初级免疫反应5类在结构和功能上不同的Ig由长寿的由长寿的T细胞和细胞和B细胞记忆细胞记忆IgA：唾液、肺、肠道等的分泌液。唾液、肺、肠道等的分泌液。IgE：存在于已结合抗原的组织中。存在于已结合抗原的组织中。IgD：成熟的成熟的B淋巴细胞表面。淋巴细胞表面。至至20002000年底，在美国药品市场上生物技术药物年底，在美国药品市场上生物技术药物 有有7676种，其中抗体药物有种，其中抗体药物有1515种。种。20192019年治疗用单抗销售总额已超过年治疗用单抗销售总额已超过5252亿美元。亿美元。20192019年约有年约有50-6050-
4、60个治疗性单抗上市。个治疗性单抗上市。20192019年预计单抗销售额年预计单抗销售额200200亿美元。亿美元。美国已占全球单抗市场美国已占全球单抗市场90%90%一支独秀一支独秀。完全完全人源化人源化单抗现有多个处于临床前阶段。单抗现有多个处于临床前阶段。抗体制药抗体药物Antigenic determinant抗原決定基（簇）一个抗原分子上可能有数个抗原決定基每个抗原決定基至少诱生一种专一性抗体蛋白质性抗原決定基：含有六个以上氨基酸整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗
5、体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体制药 多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的抗原决定簇的多种抗体混合物多种抗体混合物。如。如:免疫血清（含多免疫血清（含多种特异性抗体）。种特异性抗体）。实际意义：（1 1）预防、治疗感染性疾病）预防、治疗感染性疾病如：破伤风抗毒素血清如：破伤风抗毒素血清 抗抗破伤风；破伤风；胎盘球蛋白胎盘球蛋白 抗病毒感染抗病毒感染等；等；副作用：副作用：超敏反应超敏反应 （2 2）临床诊断）临床诊断如：肥达氏反应如：肥达氏反应伤寒、副伤寒伤寒、副伤寒缺点
6、：特异性差，缺点：特异性差，易出现易出现非特异性交叉反应非特异性交叉反应。抗体制药超敏反应（hypersensitivity）异常的、过高的免疫应答异常的、过高的免疫应答。即机体与抗原性。即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应，致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应，又称又称变态反应变态反应。引起超敏反应的抗原性物质可以。引起超敏反应的抗原性物质可以是完全抗原（异种动物血清、组织细胞、微生物、是完全抗原（异
7、种动物血清、组织细胞、微生物、寄生虫、植物花粉、兽类皮毛等），也可以是半寄生虫、植物花粉、兽类皮毛等），也可以是半抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等药物，或生抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等药物，或生漆等低分子物质）。漆等低分子物质）。各种类型的超敏反应型超敏反应型超敏反应：主要疾病有：全身性过敏反应、皮：主要疾病有：全身性过敏反应、皮肤超敏反应、消化道超敏反应、呼吸道超敏反应。肤超敏反应、消化道超敏反应、呼吸道超敏反应。型超敏反应型超敏反应：主要引起的疾病有：输血反应、新：主要引起的疾病有：输血反应、新生儿溶血症、免疫性血细胞减少症。生儿溶血症、免疫性血细胞减少症。超敏反应超敏反应：引起的疾病
8、有：引起的疾病有:血清病、感染后肾小血清病、感染后肾小球肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、过敏球肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、过敏性休克样反应、毛细支气管炎。性休克样反应、毛细支气管炎。超敏反应超敏反应：主要临床疾病有结核菌素反应、传染：主要临床疾病有结核菌素反应、传染性超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应性超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234 抗抗体体X-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体传统抗体(抗血清抗血清)是所有抗是所有抗体
9、体的混和的混和 脾脾脏产生各种脏产生各种 B 細胞細胞免免疫前要先疫前要先把抗原作把抗原作成乳成乳剂剂免免疫疫 抗原抗原采采血血后后可得可得传统传统抗血清抗血清已建立之小鼠已建立之小鼠骨髓癌骨髓癌细细胞株胞株由脾由脾脏脏收集收集 B 細胞細胞抗原通常有多抗原通常有多个个抗原決定基抗原決定基免免疫疫后后的脾的脾脏脏约约在在两两月內月內注射五到八次注射五到八次Ag X传统传统抗血清的交叉反应抗血清的交叉反应专一性反应专一性反应沒有反應沒有反應交叉反应交叉反应 单克隆抗体的特点q高度特异性高度特异性q均一性均一性q来源稳定来源稳定q可大量生产可大量生产 抗体制药 1975 1975年年Kohler和
10、和Milstein首先利用首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。）。可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细癌细胞胞可培可培养养生生长长浆浆细细胞胞B cell可分泌抗体可分泌抗体融融合瘤合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细细胞胞融融合合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個一個 B cell 只只产生一种抗体产生一种抗体 一一个个 B 细细胞只能生胞只能生产产一一种种抗体，抗体，对
11、对付某一付某一 抗原決定基。抗原決定基。若有若有许许多抗原決定基，多抗原決定基，则则需需许许多株多株 B 細胞分別生細胞分別生产许产许多抗体。多抗体。BBBYYYY抗 原BYB亲亲和力成熟和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基抗原決定基1234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开单克隆抗体 单克隆抗体的应用q作为抗体制剂，用于疾病的诊断和治疗。作为抗体制剂，用于疾病的诊断和治疗。q检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。q放射性核素标记放射性核素标记单抗单抗进行肿瘤显像，做免疫进行肿瘤显
12、像，做免疫定位诊断。定位诊断。qCD3单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。斥有抑制作用。q以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。向治疗。抗体制药McAb在免疫导向疗法中存在的问题在免疫导向疗法中存在的问题 A A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗 体（体（HAMA），），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作用靶组织时间；维持有效药物作用靶组织时间；B B、完整的抗体分子的相对分子质量过大
13、，难以穿透实体肿完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题需要解决的问题 A A、降低降低McAb的免疫源性的免疫源性；B B、降低降低McAb的相对分子质量的相对分子质量。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 19841984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性）
14、，相对分子质量只有完整抗体分子的有完整抗体分子的1/801/3。单克隆抗体第二节 单克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的决定族的抗体，又是单一的B 淋巴细淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。抗体制药抗体制药抗体制药-d细细胞融合胞融合-a-b-c-dAgX
15、AgXHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤融合瘤细细胞胞（Subcloning）(确确定只有一定只有一种细种细胞胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨骨髓髓癌癌细细胞胞B cell脾脾细细胞胞分株培分株培养筛选养筛选筛选筛选单单抗抗传统抗体传统抗体(抗血清抗血清)试验专试验专一性一性对对抗抗原原的的反反应应无无法法分分辨辨完完全全不不同同d旧旧有抗原有抗原d新的抗原新的抗原 一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。抗
16、原进行动物免疫。为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。免疫。单克隆抗体 抗原与动物免疫q免疫方法免疫方法：体内免疫和体外免疫：体内免疫和体外免疫q抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原q骨髓瘤细胞系骨髓瘤细胞系：来自：来自BALB/c小鼠和小鼠和 Lou大鼠大鼠q免疫动物免疫动物：BALB/c小鼠小鼠和和Lou大大鼠鼠单克隆抗体白化小鼠原种，命名为白化小鼠原种，命名为BALB/c品系。品系。1985年我国从美国引进到中国医学科学院实验动物年我国从美国引进到中国医学科学院实验动物研究所，为研
17、究所，为BALB/c第第180代。毛色：白化。代。毛色：白化。主要特性主要特性：乳腺肿瘤自然发生率低。易患：乳腺肿瘤自然发生率低。易患慢性肺炎。对放射线甚为敏感。与其他近慢性肺炎。对放射线甚为敏感。与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。有自交系相比，肝、脾与体重的比值较大。有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对动脉硬化。对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。主要用途主要用途：
18、广泛地应用于肿瘤学、生理学、免：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。BALB/c小鼠小鼠 体内免疫法 适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用用8 81212周龄雌性鼠。周龄雌性鼠。颗粒性抗原颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔可不加佐剂，直接注入腹腔10107 7个细胞进行初次免疫，个细胞进行初次免疫，间隔间隔1 13 3周，再追加免疫周，再追加免疫1 12 2次。次。可溶性抗原可溶性抗原按每只小鼠按每只小鼠10
19、10100100g抗原与福氏完抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔隔2 24 4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1 12 2次。次。一般再采脾细胞前一般再采脾细胞前3 3日由静脉注射最后一次抗原。刺日由静脉注射最后一次抗原。刺激激B B细胞分裂。细胞分裂。单克隆抗体 脾内免疫法脾内免疫法即在麻醉下直接将即在麻醉下直接将 0.1 0.10.2ml0.2ml抗原注入脾脏进行免抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需疫。细胞抗原需10105 5个，可溶性抗个，可溶性抗原需原需10g10g。体内免疫 体外免疫法 用于
20、不能采用体内免疫的情况下，如制备用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性人源性McAb；免疫源性极弱，易引起免疫抑；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。制。优点优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。操作操作：用：用4 48 8周龄周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细小鼠的脾脏制成单细 胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5 5g/ml,在在5%5%CO2、37 下培养下培养4 4 5 5天天,再分离脾细胞再分离脾细胞,进行细胞融合。进行细胞融合。体外免疫二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养细胞融合的方法细胞融合的方法 脾细胞（脾细胞
21、（1 110108 8）骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（2 210107 7）混合混合 PEG(2min)PEG(2min)融合融合 培养液稀释融合液培养液稀释融合液抗体制药聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：融合剂，相对分子量：融合剂，相对分子量40004000，浓度为，浓度为50%50%。二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）：促融剂，增加融合率。：促融剂，增加融合率。融合率高融合率高自身不分泌抗体自身不分泌抗体产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强长期稳定长期稳定细胞融合骨髓瘤细胞的特点 杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 细胞融合后可产生多种融合细胞：细胞融合后可产生多
22、种融合细胞：脾脾-脾、脾脾、脾-瘤、瘤瘤、瘤-瘤融合细胞。瘤融合细胞。利用利用HAT选择性培养基进行淘汰选择性培养基进行淘汰：次氨甲喋呤（次氨甲喋呤（A）阻断）阻断DNA合成，合成，淘汰瘤淘汰瘤-瘤细胞和瘤细胞、脾瘤细胞和瘤细胞、脾-脾细胞、脾细胞、脾细胞；而脾细胞可利用次脾细胞；而脾细胞可利用次黄嘌呤黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（）和胸腺嘧啶（T）合成）合成DNA，使使脾脾-瘤融合细胞得以生长瘤融合细胞得以生长。细胞融合细胞融合 三、筛选阳性克隆与克隆化 常用检测方法常用检测方法q免疫酶技术免疫酶技术q免疫荧光技术免疫荧光技术q放射免疫技术放射免疫技术单克隆抗体 克隆化克隆化是指单个细胞通过无性繁
23、殖而获得细胞集是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。团的整个培养过程。常用的克隆化方法q 有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用第一次克隆化时也要应用HT培养液，以培养液，以 后的克隆化可用不含后的克隆化可用不含HT的的RPMI 1640培培 养液。养液。q 软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，细胞的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半分裂后形成小球样团块，由于培养基
24、是半 固体状态，可用吸管吸出，移入固体状态，可用吸管吸出，移入9696孔板培孔板培 养。养。单克隆抗体ELISA用于破伤风抗体的筛选单克隆抗体 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定杂交瘤细胞鉴定染色体分析染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：正常鼠的脾细胞染色体数：4040，全部为端着丝粒。，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0SP2/0细胞细胞为为6268，NS-1为为 5464，大多数为非整倍性，有中部和亚中大多数为非整倍性，有中部和亚中 部着丝点。部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细
25、胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价 的抗体；反之，则反。的抗体；反之，则反。单克隆抗体 五、单克隆抗体的大量制备体外培养法：可获的体外培养法：可获的10g/ml抗体抗体体内诱生法：可获体内诱生法：可获的的520mg/ml抗体抗体 降植烷降植烷 BALB/c小鼠小鼠 接种杂交瘤细胞接种杂交瘤细胞 取腹水取腹水 离心离心 上清液上清液单克隆抗体 六、单克隆抗体的纯化 根据根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。的
26、类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgG类类沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析IgM类类沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药亲和层析亲和层析+阴离子交阴离子交 换层析。注意除去毒换层析。注意除去毒 素、病毒、核酸等微素、病毒、核酸等微 量的污染物。量的污染物。单克隆抗体动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序纯化的一般程序 （1）澄清和沉淀处理：）澄清和沉淀处理：1000g 离心离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）纤维蛋白凝块和脂质）20 000
27、g 高速离心高速离心30min,去除残留的小颗粒物质去除残留的小颗粒物质 用用0.2 m微孔滤膜过滤，微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体去除细菌、支原体 饱和硫酸铵沉淀抗体（饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱饱和硫酸铵能回收和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。以上的抗体）。单抗纯化 动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序纯化的一般程序 （2 2）分离）分离 A、凝胶过滤、凝胶过滤：用于：用于IgG和和IgM类。类。常用常用SephadexG200 为为分离介质，收集到分离介质，收集到3个峰，最高峰为个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为，另外两个峰为 IgG。抗体回收率达抗体回收率达5
28、080%，能去除微量杂蛋白，纯度达，能去除微量杂蛋白，纯度达95%以上。以上。B、阴粒子交换层析：、阴粒子交换层析：用于用于IgG类。类。在在pH7.4条件下，条件下，IgG1和和IgG2能结合在能结合在DEAE填料上，其中填料上，其中IgG2a可在较低粒子强度可在较低粒子强度下洗脱下来，其纯度很高。下洗脱下来，其纯度很高。IgG2b和和IgG3在低离子强度下易在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。C、亲和层析：、亲和层析：多用蛋白多用蛋白A亲和层析，适用于亲和层析，适用于IgG类。类。鼠源鼠源性单抗在性单抗
29、在 pH8.0时，时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白几乎全部结合在蛋白 A柱上，柱上，IgG1稍差，用稍差，用 pH3.5缓冲液可洗脱缓冲液可洗脱 IgG2b，pH4.0缓冲液可洗缓冲液可洗脱下脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱缓冲液可洗脱IgG2a，pH6.0可洗脱可洗脱IgG1。收。收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。单抗纯化第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单抗为鼠源性，应用人杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的
30、目的：降低免疫原性；降低相对分：降低免疫原性；降低相对分子量，增加组织通透性。子量，增加组织通透性。单抗改造Ig分子结构单抗改造原理原理：抗体同抗原：抗体同抗原结结合的功能合的功能决定于抗体决定于抗体分子的分子的可变区可变区（V），），同种性同种性免疫原性免疫原性则决则决定于抗体分子的定于抗体分子的稳定稳定区区（C）。）。1个个Fab片段片段1个个Fc片段片段Ig分子的基因结构单抗改造单抗改造一、人鼠嵌合抗体（chimeric antibody）在基因水平上将在基因水平上将鼠源鼠源单抗的单抗的可变区可变区（V）与）与人人的的稳定区稳定区（C）融合而得到的抗体。）融合而得到的抗体。单抗改造 构建
31、构建嵌合抗体嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的大致过程是，将鼠源单抗的的可变区基因可变区基因克隆出来，连到包含有克隆出来，连到包含有人抗体稳人抗体稳定区基因定区基因及表达所需的其它元件及表达所需的其它元件(如启动子、如启动子、增强子、选择标记等增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳的表达载体上，在哺乳动物细胞动物细胞(如骨髓瘤细胞、如骨髓瘤细胞、CHO细胞细胞)中表达。中表达。单抗改造 克隆鼠单抗的可变区基因，可从克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文基因组文库库中分离，也可用中分离，也可用PCR技术技术分离。分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会
32、带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。来修饰调整其效应。人人-鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性免疫原性大大降低，利于在人体内应用大大降低，利于在人体内应用，加强，加强ADCC效效应。目前已制备出上百种抗各种抗原应。目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿包括肿瘤相关抗原瘤相关抗原)的嵌合抗体。的嵌合抗体。单抗改造ADCC效应效应 即即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。其机制为靶细胞膜抗原与特异性其机制为靶细胞膜抗
33、原与特异性IgG类抗体类抗体结合形成免疫复合物后，结合形成免疫复合物后，IgG抗体的抗体的Fc段段与效应细胞与效应细胞(如如NK细胞、巨噬细胞细胞、巨噬细胞)上的上的Fc受体结合，使效应细胞活化，产生对靶细胞受体结合，使效应细胞活化，产生对靶细胞的杀伤作用。的杀伤作用。单抗改造 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出发展出CDR移植技术。移植技术。CDR移植即移植即把鼠抗体的把鼠抗体的CDR序列移序列移植到人抗体的可变区内植到人抗体
34、的可变区内，所得到的抗体，所得到的抗体称称CDR移植抗体或移植抗体或改型抗体改型抗体，也就是，也就是人人源化抗体。源化抗体。单抗改造二、改形抗体（CDR移植抗体）(Reshaping antibody)Ig 分子中参与构成分子中参与构成抗原抗原结合部位的区域结合部位的区域是是H和和L链链V区中的区中的互补决定区互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。区），而不是整个可变区。H和和L链各有链各有三个三个CDR，其，其它部分称框架区。它部分称框架区。用鼠源单抗的用鼠源单抗的CDR序序列列替换人替换人Ig 分子中分子中CDR序序列，则可使人的列，则可使人的Ig 分子具分子具有鼠源单抗的抗原结合特有
35、鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。异性。可消除免疫源性。单抗改造CDR区区单抗改造三、小分子抗体 基因工程小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达仅表达鼠源单抗的鼠源单抗的V区片段区片段，相对分子量为原抗体的，相对分子量为原抗体的1/801/3。即。即保留保留CDR区，而区，而Ig 分子中的分子中的C区不表达。区不表达。小分子抗体类型有小分子抗体类型有 Fab片段抗体：片段抗体：VH+CH1 Fv抗体：抗体：VH+VL 单链抗体单链抗体：VH-Linker-VL 单域抗体：单域抗体：VH或或VL 最小识别单位（最小识别单位（MRU）单抗改造小分子抗体的优点单抗改造小分子抗体由完整的由完整的轻
36、链和轻链和Fd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/3。把把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽作用下，与细菌的前导肽相连，在前导肽作用下，Fab进入质周腔，装配折叠后具有结合抗原的活性。进入质周腔，装配折叠后具有结合抗原的活性。（1）Fab（VH+CH1）小分子抗体 Fv、ScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/6。（2）Fv（VH+VL）或或 ScFv FvScFv连接肽连接肽小分子抗体Fv由由VH与与VL构成，由于其结合是非共价构成，由于其结合是非共价结合，故结合，故Fv不稳定不稳定。在在VH与与VL之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把VH与与VL连成一条单
37、链，得到连成一条单链，得到ScFv，即即单链抗体单链抗体。连接肽连接肽的长度在的长度在10-15个氨基酸个氨基酸左右，不左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。小分子抗体单链抗体大多在大肠杆菌中表达直接在细胞质中表达；直接在细胞质中表达；与其它菌体融合表达融合蛋白；与其它菌体融合表达融合蛋白；分泌表达具有功能的单链抗体。分泌表达具有功能的单链抗体。小分子抗体 即为即为VH，约为完整分子的，约为完整分子的1/12。它只由。它只由一个结构域构成，故称一个结构域构成，故称单域抗体
38、单域抗体。单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。特异性。（3）单域抗体（VH或或VL）VH小分子抗体约为完整分子的约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由大小，一般由一个一个CDR构成，它也保持构成，它也保持着抗体的特异性。着抗体的特异性。（4）最小识别单位（MRU）CDR小分子抗体四、双功能抗体 即双特异性抗体（即双特异性抗体（BsAb）。它是一种。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。乃是一种小分子的双价双不同的特异性。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。特异性抗体
39、片段。单抗改造 双特异性抗体双特异性抗体是指能同时识别是指能同时识别2种抗原种抗原的抗体。的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原，另种为对应肿瘤相关抗原，另1种种为对应效应成分。为对应效应成分。即能即能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高细胞结合高细胞毒性的效应细胞毒性的效应细胞，将效应细胞富集在肿瘤，将效应细胞富集在肿瘤周围，而且可以模拟天然配体的作用周围，而且可以模拟天然配体的作用,与细与细胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。双功能抗体 双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比，双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相
40、比，除了能除了能特异性识别肿瘤细胞特异性识别肿瘤细胞外，还能外，还能将循环血将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处，从，从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强，发挥免疫导而使效应细胞的抗肿瘤活性增强，发挥免疫导向作用，这是肿瘤治疗的新突破。向作用，这是肿瘤治疗的新突破。双功能抗体双功能抗体多价小分子抗体多价小分子抗体五、抗体融合蛋白 从广义讲应属于双功能抗体范畴。类型：从广义讲应属于双功能抗体范畴。类型：（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如 IL-2-Ig（3）配基）配基FV型嵌合蛋
41、白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3（4）受体）受体FV型融合蛋白型融合蛋白（5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme，抗体酶），抗体酶）单抗改造第四节 基因工程抗体和抗体工程 抗体研究的三个阶段：以抗体研究的三个阶段：以1890年年Behring发现发现白喉抗毒素为代表，其特点是白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得用抗原免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体；以；以19751975年年Khler创建创建杂交瘤技术制备杂交瘤技术制备单克隆抗体单克隆抗体为代表；以为代表；以19941994年年Winter以以基因工程方基因工程方法制备抗体法制备抗体为代表。通过细菌发酵
42、或转基因动物或转为代表。通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体，在此基础上发展成抗体工基因植物大规模生产抗体，在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体程。他创建了噬菌体抗体库技术抗体库技术，克服了人体不能随，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得获得人源性基因工程抗体人源性基因工程抗体。抗体制药抗体库技术 抗体库技术是用基因工程方法把人或抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的其他动物的全部抗体的轻全部抗体的轻、重链可变区基重链可变区基因因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需
43、的特异基因和抗体。选出所需的特异基因和抗体。抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法1.1.获取目的基因获取目的基因 提取提取RNA，经，经RT-PCR获取抗体某一特定基因区段。获取抗体某一特定基因区段。2.2.抗体库技术的载体抗体库技术的载体 普遍使用噬菌粒（普遍使用噬菌粒（phagemid）载体。）载体。3.3.淘筛（淘筛（panning）用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。隆，使目的克隆大量扩增。4.4.表达与鉴定表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性目的克隆经过鉴定后，再导入感受
44、态菌株，进行可溶性表达，其产物用表达，其产物用Western blot分析确定后，就完成了全过程。分析确定后，就完成了全过程。抗体工程RT-PCR 将将RNA的反转录（的反转录（RT）和）和cDNA的聚合的聚合酶链式扩增（酶链式扩增（PCR）相结合的技术。）相结合的技术。抗体工程反转录酶反转录酶RNA cDNA 扩增目的片段扩增目的片段 PCR噬菌体抗体库的噬菌体抗体库的“吸附一洗脱一扩增吸附一洗脱一扩增”富集性选择过程富集性选择过程二、噬菌体抗体库技术的特点1.1.模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过1011库容，能包含库容，能包含B细胞全部细胞
45、全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，是人体多克隆扩增，是人体多克隆细胞的总细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。种属普遍性。VH和和VL基因的随机重组增加了抗体的多样性。基因的随机重组增加了抗体的多样性。2.避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，
46、因而能避免使用任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。人工免疫动物和细胞融合技术。3.可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，在噬菌体抗体库技术中，VH和和VL基因的随机重组模拟基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。抗体工程三、基因工程抗体的表达1.1.原核细胞表达原核细胞表达2.2.真核细胞表达真核细胞表达 酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细
47、胞、真菌等。酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。3.3.转基因植物表达转基因植物表达 烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白量的量的1.3%1.3%。4.4.转基因动物表达转基因动物表达 单基因水平上做转基因鼠。单基因水平上做转基因鼠。抗体工程第五节 抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。种反应。在体内在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗抗体类药物可用于治疗。在体外在体外，由于抗原性状和反应条
48、件不同，可发生凝集或沉淀等由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原抗体来鉴定抗原；做病原学诊；做病原学诊断和血型测定，称为断和血型测定，称为血清学鉴定血清学鉴定。抗体诊断药物基本。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。制剂，以及体内导向诊断药物。抗体制药一、血清学鉴定用的抗体类试剂1.1.鉴定病原菌用的抗体试剂鉴定病原菌用的抗体试剂（1 1）常用诊断血清的品种和用途）常用诊断血清的品种和用途 见书见书 162 162页表页表4 46 6。
49、抗体诊断试剂1.1.鉴定病原菌用的抗体试剂鉴定病原菌用的抗体试剂（2 2）诊断血清的制备步骤）诊断血清的制备步骤a a、制备细菌抗原制备细菌抗原 细菌接种细菌接种培养收集菌苔培养收集菌苔制成菌液制成菌液b b、免疫动物和制备抗体血清免疫动物和制备抗体血清 动物：家兔、马、羊、动物：家兔、马、羊、豚鼠豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数接种次数37次，每次间隔次，每次间隔34d，末次，末次注射后注射后68d取取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。c c、诊断血清的诊断方法诊断血清的诊断方法 直接凝集反应。直
50、接凝集反应。抗体诊断试剂豚鼠2.2.乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂（1 1）试剂制备原理试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。而使血细胞发生凝集。（2）制备步骤制备步骤：先用：先用HBsAg免疫豚鼠免疫豚鼠获得抗获得抗HBs血清血清硫硫酸铵盐析酸铵盐析/柱层析柱层析取其取其IgG在在
