1、药检所 夏春丽 ）、1.3 .质地 指药材的软硬、坚韧、疏松、致密、黏性或粉性等。软硬 坚韧多凭手感而定，疏松 致密 黏性 粉性等全凭眼睛仔细观察。如山药片粉性足，郁金片坚硬，通草质松软，蜜炙饮片黏性大等。.断面 包括折断时横断面的纹理特征。如杜仲折断有橡胶丝（盐炙后橡胶丝不明显）；甘草易折断，断面纤维性等。.气味；一般可直接嗅闻或口尝。气味较弱者可采用折断或揉搓的方法，也有的需要热水湿润后才能闻到。.水试 将药材浸泡一定量水中，观察形态变化。菟丝子的吐丝现象.观察在水中的沉浮 如：丁香沉于水中为佳；进口沉香能沉于水或半浮半沉于水中，国产沉香大多不能沉于水中。.观察颜色变化 如：西红花浸入水中
2、，可见橙黄色成直线下降并逐渐扩散，水被染成橙黄色，柱头呈喇叭状；熊胆粉末投入清水，即在水面旋转，并呈现黄线下沉而不扩散；栀子水浸液为鲜黄色；玄参水浸液为淡黑色；秦皮水浸液日光下显碧蓝色荧光。.观察有无粘性 如：海藻水浸后藻体表面粘滑；葶苈子、车前子加水浸泡种子表面粘滑，水煮后溶液有粘性。.观察膨胀情况 如：胖大海水浸泡迅速膨大成海绵状，达原体积4倍，假胖大海水浸泡膨胀较慢，仅能达原体积的2倍；蛤蟆油水浸可膨胀至倍。.观察其他特殊变化 如：菟丝子水浸加温后便逐渐出现吐丝现象（种皮开裂可露出黄白色卷旋状的胚，形如吐丝。）；水牛角热水浸泡有腥臭气；蟾酥遇水即泛出白色乳状液等。三 经过加工炮制后的，可
3、直接用于中医临床的中药。经过加工炮制后的，可直接用于中医临床的中药。1砒石（红砒、白砒）2砒霜 3水银4生马前子 5生川乌 6生草乌 7生白附子 8生附子 9生半夏 10生南星 11生巴豆 12斑蝥 13青娘虫 14红娘虫 15生甘遂 16生狼毒 17生藤黄 18生千金子 19生天仙子 20闹阳花 21雪上一枝蒿 22红升丹 23白降丹 24蟾酥 25洋金花 26红粉 27轻粉 28雄黄 薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。1.仪器与材料 (1)玻板 除另有
4、规定外，用5cm20cm，10cm20cm或20cm20cm的规格,要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。(2)固定相或载体 最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小,一般要求直径为1040m。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用1015煅石膏(CaSO4.2H2O在140烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.50.7)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。
5、(3)涂布器 应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。(4)点样器。(5)展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。2.操作方法 (1)薄层板制备 除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。(2)点样 除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线
6、距底边2.0cm，样点直径应小于或等于3mm ,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。(3)展开 展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）,密封室盖,待展开至规定距离(一般为1015cm),取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。(4)如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定
7、外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。二、1.方法原理 薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。(1)流动相利用毛细管力带着样品
8、穿过固定相。(2)样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极-（诱导）-偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。2.薄层板2.1手工自制玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄12mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至
9、不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求2.2制作方法:除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研钵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105110)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.250.5mm.。2.2.1铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，
10、板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：23，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。2.2.2点样尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇
11、、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。2.2.3展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。2.2.4展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放
12、入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快 2.2.5温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。2.2.6显色喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。3.样品点样31点状
13、点样和条带状点样 每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1l。点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5 l），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，
14、受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。3.2 样品点样位置 起点的最佳位置距侧边2.0cm。起点下缘的最小距离点样基线距底边2.0cm。两个起点之间的距离必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离必须足够大以避免分离区失真变形。4.层析4.1展开室 4.1.1直立式双槽展开室 具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点4.1.2 水平展开室 可以从薄层板的两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规
15、上行展开的薄层板增加一倍。4.1.3 自动展开室(AMD)可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。4.2.溶剂 使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯+2 ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。5.参数5.1温度 薄层色谱分析一般在室温中进行
16、。在这过程，温度在20-25C算不上是临界值。在这过程中无短期的温度波动才是更为重要（避免抽风）。展开室应放置在无直射阳光和不通风处。温度波动对层析结果不利，故将展开室放在靠近窗口或热源处是欠妥的。5.2空气湿度 空气湿度极高或极低主要影响有非极性溶剂体系的无机涂层。相对空气湿度高于70-80%会影响薄层钝化，使Rf值增加。样品点样后，TLC薄层可置放在适当的硫酸和水的混合物的上面不少于30分钟，调整至指定的相对湿度。有关这方面的更多资料可从HPTLC Vario系统的操作手册中获得。另一方面，在样品点样前，TLC/HPTLC板可在105C再活化30分钟进行干燥。然后薄层必须用一块玻璃板保护起
17、来，只有起点区露出以便于样品点样。若空气太干燥，可在干燥器中将TLC/HPTLC薄层置于水的上方以达到所要求的状况。确定合适的层析条件的有效方法（用规定的湿度，溶剂蒸汽或溶剂调整使薄层达到要求的状况）是使用HPTLC Vario体系。控制相对湿度用的硫酸溶液下表：相对湿度 所需硫酸浓度（V/V）硫酸（ml）+水（ml）32%47%42%58%65%72%88%68.0 100 50.0 100 57.0 100 39.5 100 34.0 100 27.5 100 10.8 1006 层析后衍生作用若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化，需加试剂 方能显色或发射荧光者，则需使用适当的试
18、剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上，直接观察或加热显色后观察。加热显色者须注意加热时间和温度，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板，加热温度过高或时间过长，容易引起板面的焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果。有的成分加试剂后，如挥发油成分经香草醛硫酸显色，加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。有的品种可熏以试剂或试液的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）显色。6.1 喷雾 试剂溶液以气溶胶的形式均匀地喷洒在薄层上。电动的TLC喷雾器用最少的试剂溶液产生几近理想的气溶胶。6.2 浸渍 使用适当的设备如色谱浸渍设备III（Chromotogram Immersion Device
19、 III）,TLC/HPTLC板浸渍具有重现的结果。通过设定垂直方向速度（进入，抽出）和规定停留时间，浸渍条件可被精确地标准化。7检测 7.1 定性分析（同一性试验）在相同的状态下（相同类型的TLC/HPTLC板、相同的溶剂体系组成、相同的组份点样体积和其它TLC设备系统），样品成份的Rf值、颜色、与专用的或特殊基因衍生化试剂的反应和参考物或标准物在同一TLC/HPTLC板同时层析所得的结果相符时，未知物就可认为是存在而被鉴别出来。分析的结果可以采用照片，照片复制品，影像记录（如：CAMAG 薄层色谱数码成像系统）或TLC扫描仪方法记录下来。为增加测试物与参照物同一性的可信度，采用TLC扫描仪
20、实时记录其紫外光和可见光图谱并进行比较。7.2 定量分析（仪器：CAMAG scanner-3；具体操作请参考操作手册或教学软件）定量分析采用光密度扫描法来评价。用winCATS 软件控制薄层色谱扫描仪以及进行扫描结果的数据处理，计算出各成分的峰高和峰面积及其平均值和离散系数（CV）。通过单水平或多水平校准计算出结果。最后以报告形式将所有扫描参数、原始资料及图像结果保存及打印。扫描狭缝宽度根据被测成份斑点的大小来调整（1）点状点样得到TLC中各成份，扫描其全宽度；（2）条带状点样，通常可以扫描其色谱带同心部分的50-70%。物质的扫描波长可以通过光谱扫描来决定。TLC/HPTLC板空白部位的漫
21、射反射光用光电倍增器（PM）来收集并定其值为10%。扫描吸光物质时，其吸收随着物质的量而增加。对于具有荧光或可转变成具旋光性衍生物的物质的测定。光源一般使用发射光谱在254-578 nm之间的高压汞蒸汽灯，在254，302，313，366，405，436，546和578nm处有特别高强度的谱线。吸收了选择性激发波长后TLC中各成份发射出的较长波长荧光由光倍增器记录下来，使用锐截止滤波器或窄带滤波器将会阻止TLC/HPTLC板反射的激发波长光到达光电倍增器。和吸附测定一样，荧光强度作为板上定位的函数作图得模拟曲线（荧光定位曲线）。TLC扫描仪的测定原理在有关的设备文献中有报导。荧光测定比吸收测定
22、优越在于如下几点：（1）检出极限低1-3个数量级；（2）在较宽的浓度范围内校准曲线呈线性；（3）选择性较高。8.影响薄层色谱分析的因素（）样品的预处理及供试液的制备 制备样品供试液所用的溶剂溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中。如一捻金中人参二醇及人参三醇的鉴别，若用稀酸水解后直接用氯仿萃取，点样层析，色谱因大黄成分干扰，斑点很难辨认，经碱性氧化铝小住吸附净化后，除去了大部分干扰，结果色谱清晰，人参二醇及人参三醇很容易辩认。（）薄层色谱的点样技术 点样是薄层色谱分析非常关键的步骤。它既关系到能否得到可以重新的有良好分离度的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确。（）吸附剂的活性与相对湿度对薄层
23、色谱的影响（）溶剂蒸气在薄层色谱中的作用 应注意：预平衡、预饱和、完全饱和三者的区别 只需要展开剂的蒸气在展开箱中预平衡一定时间，称预平衡 预吸附：薄层板的干燥板面对展开箱空间气体分子的任何程度的吸附称预饱和 吸附饱和：薄层板的干燥板面与展开箱的饱和气体空间达到平衡状态称完全饱和（）薄层色谱的优化及溶剂系统（）温度对薄层色谱的影响（）影响薄层色谱的其它因素 操作技巧和熟炼程度以及所有的器材、溶剂、试剂等的质量。流动相极性大于固定流动相极性大于固定相的极性的色谱相的极性的色谱（反相）（反相）流动相流动相甲醇水甲醇水(70:30)色谱柱色谱柱C18流速流速1mlmin检测器检测器UV254nm样品
24、样品苯酚苯酚 苯乙酮苯乙酮 硝基苯硝基苯 苯甲醚苯甲醚 甲苯甲苯极性键合相极性键合相流动相流动相正己烷正己烷/异丙醇（异丙醇（75：25）色谱柱色谱柱腈基腈基流速流速1mlmin检测器检测器UV254nm样品样品硝基苯硝基苯 卞醇卞醇 2-4二硝基甲苯二硝基甲苯 对硝基卞醇对硝基卞醇流动相极性小于固定流动相极性小于固定相的极性的色谱相的极性的色谱（正相）（正相）流动相流动相正己烷正己烷/二氯甲烷二氯甲烷/异丙醇胺（异丙醇胺（95：4：1）色谱柱色谱柱硅胶硅胶流速流速1mlmin检测器检测器UV254nm样品样品2-苯苯-2-丙醇丙醇 甲卞醇甲卞醇 肉桂醇肉桂醇三、由柱引起的故障及解决办法由柱引起的故障及解决办法谢谢谢谢大大家家！结结束束
