1、流式细胞术在白血病/淋巴瘤分型与监测中的应用1世界卫生组织血液肿瘤分类方案(19991999年)“新分类方案的基本原则是:结合形态学、免疫表型、遗传改变与临床特征来鉴定疾病的真实本质”。“这为世界各国肿瘤学家与病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新篇章,必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”(美国临床肿瘤协会,临床肿瘤杂志 17卷3835-3849页,1999年)更重要的是提供了疾病分类与治疗选择与预后判断的较明确关联性,开启了血液肿瘤靶向性治疗与个性化方案的新时代。2白血病分子诊断的意义系统诊断白血病初发异常标记精确诊断准确预后指导治疗科研资料残留监测靶向治疗免疫/遗传学靶标MI
2、CMMICM诊断3WHO血液肿瘤新分类实验技术平台 实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传与分子生物学实验技术平台以及掌握这类实验技能并具有专业知识的人员。45Investigative Tools for MM diagnosis and Management(2008 ASH Education Program Book p298)Patient Evaluation 诊断单克隆蛋白数量与特征血清蛋白电泳与免疫球蛋白定量24小时尿蛋白;总蛋白;本周蛋白尿与血清免疫固定血清自由轻链与比例骨髓检查与骨髓活检Bone marrow aspiration and biopsy组化免
3、疫分型-克隆检定,及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余 例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞 终末器官损害评价 全血细胞计数;生化检查:血清肌酐与骨钙测定 预后评估球蛋白,betta-2微球蛋白,LDH,CRP骨髓细胞遗传学与FISH t(4;14),t(14;16),del 17p 针对某些特定患者的特别研究6传统流式细胞术的临床应用细胞计数:CD4、CD34DNA含量:多倍数、S期结果是数据、准确性依赖于良好的质控传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用单参“白血病表型”,阳性比率大多数细胞为肿瘤细胞多为形态学/细胞化学后的确认数据由临床医师判断高分辨流式细胞的优
4、点以多参数正常抗原表达为基础结果类似病理报告用于原发性诊断与鉴别诊断用于疾病分期,治疗选择疗效监测,预后判断流式细胞术7骨髓-异质性系统中的应用多系列 Lymphocyte(T,B,NK)Monocyte Neutrophil Eosinophil Basophil Erythrocyte骨髓中各系列细胞处于连续性成熟时期必须能涵盖所有细胞8应该使用何种抗体？所有抗体必须为标准的商业化试剂没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体抗体的联合应用能使您从有限的标本中得到最大化的信息量对正常抗原表达的正确认识能帮助您有效地鉴别疾病状态相关的改变9 I II III IV B Lymphoid Matu
5、ration CD 10 FMC 7 CD 34 CD 45 CD 19 CD 20 CD 22 TdT CD 5 CD 23 Antigen Expression 103 102 101 高 分 辨 流 式 细 胞 术 能 够 鉴 别 与 分 类 所 有 骨 髓 细 胞可 以 对 每 一 个 细 胞 进 行 多 特 征 性 的 检 测 并 对 其 相 应 的 系 列 与 成 熟 的 阶 段 进 行 分 类 至 少 检 测 一 万 个 细 胞,分 辨 率 达 到 0、5%10 I II III IV V CD 45 CD 33 CD 11b CD 15 CD 34 HLA-DR CD 13 C
6、D 16 Neutrophil Maturation Antigen Density 103 102101 11CD45/SSWood(2004)Methods Cell Biology 75:559-57612正常粒系成熟模式正常 B B 系成熟Wood(2004)Methods Cell Biology 75:559-57614表达交叉系列的抗原非同步抗原共表达:CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14抗原的过度表达:早前B-ALL中CD10抗原表达缺失:泛T抗原易位抗原表达:CSF中TdT+淋巴细胞,骨髓中胸腺发育时期的T淋巴细胞光散射异常:FSC与SSC白血病相关的免疫表型特
7、点15AML-M016AML-M2R1R2R3R417AML-M3R1R2R3R418AML-M419AML-M5R1R2R3R4R520B-ALLR1R2R3R4Date:Name:zhang yixiNo.090824321Burkitt淋巴瘤/白血病成熟B-ALLR1R2R4R5R622MAL T+G R1R2R3R4R5R1R2R3R4R5MAL T+B 23AULR1R2R3R4R524B-CLL/SLLR2R3R4R5R1Date:Name:xu zhongyuNo.090817525HCLR1R2R3R4R526大B细胞淋巴瘤27MMR1R2R3R4R5R6Name:he yin
8、yanDate:No.090727828T-ALLR1R2R3R429NK-LGLR1R2R3R4R5R6R730报告包括 出现或缺乏的异常细胞群 异常免疫表型 相比正常细胞群的抗原强度 增强,减弱,缺失 定量层面的判断 相关于全部CD45阳性细胞(WBCs)出现的其它细胞群31R1R2R3R432TCRV克隆33小结流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断 更加确定的诊断 排除其她疾病 有助于细分亚型 更准确的原始细胞辨别与定量 有助于预后判断 治疗后监测 快速34免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型,两者的结果可一致或不一致;对有些病例,尤其是髓系白血病亚型,免疫表型分析并
9、非特异;关于复杂的病例,需结合多种检查,如特异性染色体核型分析或融合基因综合判断。35目前由于多种化疗药的联合应用,使多数白血病患者能够获得形态学的完全缓解(CR)。但多数患者不能维持长期缓解,仍有相当多的患者再次复发。复发的主要缘故是患者体内存在少量的形态学难以辨认的残存白血病细胞。假如能够准确检测患者体内残存的白血病状态,能够有的放矢地进行治疗,使患者幸免许多不必要的痛苦。36MRDOutline of Leukemic DiagnosisMorphology:1-5%,Cytogenetics:1-5%,Flow cytometry:0、1-0、01%,RT-PCR:0、01-0、001
10、%CRPrimary leukemiaOSChemotherapiesAuto SCTAllo SCTInductionLeukemic cells1012 1010 109 108 107 106100%1%0、1%0、01 0、001 3738Molecular Measurements of Treatment ResponseClinical Application(2008 ASH Education Program Book p367)Application Action 检测治疗早期的反应佳 加强治疗 检测治疗早期的反应差 无需加强治疗 检测复发加强治疗,准备HSCT HSCT前
11、MRD 评估 优化HSCT的时间 HSCT后MRD评估 调整免疫抑制治疗时间,等 临床试验结束时的MRD评估 评价新的抗ALL药物或治疗的结果39MRD与预后当残存白血病细胞10-2,3年复发率为76-94%10-3残存白血病细胞10-2,3年复发率为37-53%残存白血病细胞10-3,3年复发率为8-20%残存白血病细胞 95%儿童ALL 90-95%成人 ALLAML 85%儿童 AML 80-95%成人 AML43报告模板44病例一 AMLAML病例资料:女,3岁,2009、6 初发FCMFCM印象:在CD45/SSC点图上设门分析,原始细胞分布区域可见异常细胞群体,约占有核细胞的26%
12、,主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117,(CD19+2、27%)。淋巴细胞比例降低。提示:急性髓系细胞白血病(AML-M2估计)。基因:AML1/ETO 阳性。02565127681024data.008SSC-Height-101010101001234data.002CD33 PE-45病例一(续1 1)2009、7 化疗 D33D33:FCMFCM:可见残留,CD33+CD19+细胞约占0、04%。基因:AML1/ETO 阳性。101010101001234data.004SSC-Height-101010101001234data.004C
13、D33 PE-462009、9 D70D70:FCMFCM:未做。基因:AML1/ETO 阴性。2010、3 D245D245:FCMFCM:未见免疫表型明显异常的细胞。基因:AML1/ETO 阴性。101010101001234Data.004CD33 PE-病例一(续2 2)101010101001234Data.002SSC-Height-47病例二 B-ALLB-ALL病例资料:男,3岁,2007、3 初发FCMFCM印象:在CD45/SSC点图上设门分析,CD45弱表达分布区域可见异常细胞群体,约占有核细胞的45%,表达HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD34、CD38、
14、Gly-A、cCD79a、TdT。提示:急性B淋巴细胞白血病(普通型B-ALL)。基因:BCR/ABL阴性。02565127681024Data.003SSC-Height-101010101001234Data.010CD10 FITC-482008、11 化疗 第2020个月:FCMFCM:未见明显表型异常的残留白血病细胞。(未附图)基因:未做。2009、09 化疗 第3030个月:FCMFCM:可见残留,在CD45dim/-区域可见约1、87%的CD10+CD19+CD20-细胞与约1、55%的HLA-DR+CD19+CD34+细胞,考虑为残留白血病细胞。(见右图)基因:未做。病例二(续
15、1 1)101010101001234data.002CD10 FITC-101010101001234data.002CD10 FITC-101010101001234data.003CD34 PE-101010101001234data.003Anti-HLA-DR FITC-101010101001234data.002SSC-Height-49病例二(续2 2)2010、03 化疗+DC-CIK 第3636个月:FCMFCM印象:在CD45/SSC点图上设门分析,CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体,与有核红细胞无分界,共约占有核细胞的89%,主要表达HLA-DR、CD1
16、0、CD15、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、cCD79a、TdT。提示:结合病史,考虑急性B淋巴细胞白血病(普通型B-ALL)复发。基因:ALL基因筛查示TSL/ERG阳性,其余均阴性。02565127681024Data.006SSC-Height-101010101001234Data.006CD22 PE-101010101001234Data.007CD10 FITC-101010101001234Data.007CD10 FITC-50病例三 T-ALLT-ALL病例资料:女,3岁,2008、10 初发FCMFCM印象:在CD45/SSC点图上设门分析,原始细胞分
17、布区域可见异常细胞群体,约占有核细胞的59%,与淋巴细胞分界不清,表达HLA-DR、CD5、CD7、CD33、CD34、CD38、cCD3。提示:急性T淋巴细胞白血病 。基因:E2A、MLL、TEL、BCR融合基因均阴性。02565127681024Data+.002SSC-Height-51病例三(续1 1)2009、05 化疗 第7 7个月:FCMFCM印象:存在CD33+CD5+HLA-DR+(0、01%)、CD34+cCD3+(0、11%)、CD7+CD117+(0、07%)等免疫表型明显异常的T淋巴细胞,考虑为残留白血病细胞。基因:未做。101010101001234Data.002CD33 PE-101010101001234Data.003CD7 FITC-101010101001234Data.005cCD3 PE-101010101001234Data.002Anti-HLA-DR FITC-101010101001234Data.002SSC-Height-感谢您的聆听！
