1、博晖呼吸道病毒检测博晖呼吸道病毒检测意义意义呼吸道病原体检测博晖创新市场部1/18/20162021/4/272小儿呼吸道疾病 小儿呼吸道疾病包括上、下呼吸道急慢性感染性疾病，呼吸道变态反应性疾病、胸膜疾病、呼吸道异物、呼吸系统先天性畸形及肺部肿瘤等。儿童呼吸道感染的主要表现为咽炎、扁桃体炎、甚至可引起支气管炎及肺炎等。其中急性呼吸道感染最为常见，约占儿科门诊的60%以上，在住院患儿中，上、下呼吸道感染站60%以上，绝大部分为肺炎，且仍是全国5岁以下儿童第一位的死亡原因。2021/4/273由于呼吸道病原体感染后同一种病原体可引起多种临床症状，不同的病原体亦可引起相似的临床症状，严重影响了临床
2、诊断及治疗，因此，一种便捷、灵敏、准确的检测方法至关重要。急性上呼吸道感染中90%由病毒引起。小儿呼吸道疾病2021/4/274 甲型和乙型流感病毒均属正粘病毒科，其基因组都是由8节段的负链单股RNA组成。其结构主要由核心、基质蛋白（M蛋白）、包膜三部分组成。位于基质蛋白之外的双层脂质，来源于宿主细胞膜，其包含有两种重要的糖蛋白，具有重要的抗原性：即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。甲型流感病毒或乙型流感病毒主要经空气飞沫传播，感染患者的临床主要症状为咳嗽、打喷嚏、流涕、鼻塞、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状，部分病人伴有呼吸局促、支气管炎或肺炎发生，可持续数周
3、或数月。甲型和乙型流感病毒2021/4/2752021/4/276腺病毒 腺病毒颗粒直径6090nm，没有囊膜，20面体立体对称，衣壳由252个壳微粒组成。呼吸道腺病毒感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等。主要为空气飞沫传播，密切接触（手鼻）传播等。潜伏期一般在56天。呼吸道腺病毒感染多发生在冬末、春初。在婴幼儿、家庭、医院及新兵等群体中常可引起流行。2021/4/277腺病毒2021/4/278呼吸道合胞病毒RSV 呼吸道合胞病毒是一种RNA病毒，属副粘液病毒科。在电镜下所见与副流感病毒类似，病毒颗粒大小约为150nm。呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿和易感成人严重
4、呼吸道感染的重要病原体，该病经空气飞沫和密切接触传播。其广泛分布于世界各地，发病率高，在婴幼儿、老年人和免疫低下的人群中容易爆发流行。潜伏期37日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。2021/4/279呼吸道四病毒诊断临床意义1.为疾病诊断和鉴别诊断、临床疗效观察和预后提供依据2.符合循证医学原则，提升医疗诊治科学性。症状学诊治转变为病因学诊治3.客观上降低抗生素滥用、缩短不必要的病程4.减少不必要的病患痛苦、降低不必要的经济负担5.不同的病因，不同的自然病史，不同的临床
5、相，不同的预后转归判断2021/4/27101.病毒治疗针对性强;病毒治疗有时效性2.避免抗生素的滥用3.可用于呼吸道病原学的研究4.提高医院对于呼吸道病毒的诊疗水平5.还可用于呼吸道传染病流行的监控为什么要早期联合检测？2021/4/2711荧光免疫特点.1.四种病毒同时检测2.快速检测，随到随检，反应时间15分钟，读数时间10秒机器检测；3.机器检测，结果准确，避免人为读数误差；4.检测峰高对比值，有效避免假阳性，有效检测时间窗显著长；5.易于实现全自动化操作，简化客户操作，提高工作效率；6.易于实现信息化，可与LIS、HIS连接；7.信息自动存储，便于数据检索和分析；8.技术平台可扩展到
6、更多的检测项目。2021/4/2712方法学特点病毒分离培养技术特异性强、时间长、成本、技术要求高、敏感性不强电镜检测结果直观、准确，设备昂贵、专业性强、人员要求高、病毒滴度要求高不符合常规临床检测 免疫学方法敏度高;特异性强;应用面广易于普及,试验结果显而易见;试验条个体要求低,缺点:操作步骤繁锁、自动化水平不高分子生物学方法灵敏度、准确性高，时间长设备和操作人员专业要求高、成本昂贵免疫学方法，因检测准确、速度快、应用面广得到临床门诊青睐！临床常见的病原学检测方法2021/4/2713双抗体夹心法:当样本加入测试卡后，病毒抗原与荧光标记抗体形成反应复合物，在层析作用下，反应复合物沿硝酸纤维膜
7、向前移动，分别被硝酸纤维膜检测区上预先包被的病毒单克隆抗体捕获，在检测区上形成反应带，使用荧光免疫分析仪检测出反应带上的荧光值，当荧光值等于或高于检出限时，显示为阳性。腹泻病毒检测新项目的临床应用双抗体夹心法:2021/4/2714荧光免疫与胶体金操作情况对比表.对比项目胶体金法免疫荧光法读数模式肉眼读数，难免个体化差异仪器读数，信号检测标准化，信号处理采用峰高对比值，检测时间窗口期显著延长，假阳性率低数据处理手动填写报告，录入登记结果，原始数据不能留存可自动保存数据，打印报告单，可调阅原始检测数据信息化（网络化）不能与LIS、HIS连接，不能实现网络化可与LIS、HIS连接，实现检测信息的网
8、络化自动化全部人工手动操作可配置自动加样设备，实现加样后全自动检测，节省人力，提高科室效率对项目平台扩展潜力/可扩展至多个检测项目，摊薄仪器购置成本负担仪器成本无仪器成本，科室负担小需负担仪器采购成本仪器故障影响无此影响影响结果检测，甚至无法出报告操作手动操作相对麻烦简便2021/4/27152021/4/2716 呼吸道病毒试剂盒操作流程 1、取样：（此步骤大多由临床医生完成。）用特制的鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储 存管中（含有缓冲液）。使用鼻咽拭子取样时，拭子进入鼻部后，应水平向鼻腔 伸入。伸入的深度约为耳垂到鼻尖的二分之一处，取样前可事先大致测量一下。二
9、岁一下的儿童，伸入深度约为拭子绒毛长度的二倍。拭子伸入至指定深度后，缓缓贴壁旋转 2-3 周，约停留 10 秒钟，取出拭子。取样后一小时内向取样管中 加入生理盐水，样本最好在24 小时内进行操作。2、样本准备步骤：（此步骤除离心以外，建议都在二级生物安全柜内操作）将样本充分震荡混匀约10-15 秒。在3000rpm 转速下离心10 分钟。弃上清。在沉淀中加5 mL PBS 缓冲液（请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩 洗液），充分震荡混匀约10-15 秒。在3000rpm 转速下离心10 分钟。吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。重复步骤4 到6，直至黏液层被完全去除。注意：一定要将黏
10、液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。以看 不见粘液为准。一般重复两到三次即可，若肉眼不可粘液，洗一次即可。在沉淀中加0.5 到1 mL 的PBS 缓冲液。视沉淀的量而定，若无可见沉淀则加 入0.2mL.用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可用 于直接样本测试。3、直接样本测试步骤：在操作前请将试剂盒内40的高浓缩洗液稀释40 倍后使用。在8 孔板上的每孔内滴加细胞悬浊液。（若在之前步骤清洗沉淀中可 明显见大块沉淀，则滴加细胞悬浊液即可。样本完全风干。风干时若操作实验室温度较低，建议置于烘箱，可以使 风干更短时间内完成。用预冷的100%丙酮固定细胞约10
11、 分钟。注意：丙酮是易挥 发、可燃性物质，使用时请远离明火。丙酮可重复使用，可用 从丙酮中取出载玻片并风干。在固定并风干的细胞上滴加对应的七种DFA 染色试剂，使其完全覆盖细胞。在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加七种DFA 染色试剂。抗原对照板包 含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。（此步骤仅 限筛查试剂）备注：以上步骤建议在二级生物安全柜中完成。将载玻片放于 恒温箱内孵育 15 分钟，为保持其湿润最好放置 于带盖的盒子内。（可置于培养皿内，或用盖子将玻片盖住均可）用事先稀释好 1 倍的洗液（试剂盒内 40洗液稀释）
12、漂洗染色细胞。为了更 有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸 4 次左右。（洗液颜色变深即可更换，一般洗10 块板左右）使用新的1 倍洗液再洗一次。请用少量的洗液冲洗玻片,用去离子水再洗一遍。4、观察实验结果与判断 滴加1 到2 滴固定液，以盖盖玻片时不产生气泡为益。并加盖盖玻片（20X50 mm），要注意避免产生气泡。在200 倍放大荧光显微镜下观察结果。试剂盒中染色液包含 FITC 荧光物标记的特异性抗体，阳性的样本会结合特 异性抗体，结果观察需要在荧光显微镜下观察。荧光需要蓝光激发，荧光激发 波长约480nm 左右。FITC 在蓝光激发下发绿色荧光，反射光波长为520nm 左右。因此，阳性
13、感染细胞应发绿色荧光。阳性结果判断：在样本孔中低倍视野下若有2 个或以上由细胞发出果绿色荧 光，即为该孔所对应的病毒阳性。实验后，已使用的鼻咽拭子、储存管、玻片等按照国家有关医疗废弃物处理规定进行处 理，无需特别处理措施。可重复使用的试剂（丙酮、试剂盒自带的漂洗液等）在达到使用次 数限制以后按照规定进行处理。2021/4/2717博晖呼吸道四项的检测流程2021/4/2718【样本要求】1.样本选择：适用于鼻咽拭子样本。具有上呼吸道感染症状或有密切接触史的人群，样本采集时间不受用药影响。2.采集器材：拭子：应使用头部为合成纤维（如聚酯纤维）的塑料杆蓬松拭子。不推荐棉拭子和木杆拭子。【样本采集】
14、1）在样本提取管内加入10滴（约500L）样本稀释液。2）将拭子完全插入鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集粘膜表皮。将采集样本后的拭子浸在样本提取管中的样本稀释液中搅拌。用力将拭子在样本提取管壁上反复旋转挤压至少10次，使样本充分溶解。将拭子提出液面并在样本提取管壁上挤压，以便提取更多液体，然后丢弃拭子，绞出的液体作为待测样本。样本要求和样本采集2021/4/2719 样本短期保存在2-8，但不应超过8小时；长期保存放置在-70下，不超过1年。样本在运输和储存过程中要尽量避免反复冻融，检测前需充分解冻。样本保存和样本运输2021/4/2720 甲型流感病毒：阳性符合率为96.05%；阴性符合率为98.
15、47%。乙型流感病毒：阳性符合率为96.95%；阴性符合率为98.67%。呼吸道腺病毒：阳性符合率为97.46%；阴性符合率为99.04%。呼吸道合胞病毒：阳性符合率为96.43%；阴性符合率为99.36%。2021/4/2721抗原和抗体抗体（英语：antibody），（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面1-2 。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。2021/4/2722抗体检测VS抗原检测机体产生IgM 一般要一周左右的
16、时间，而又免疫缺陷或免疫系统不健全的个体如儿童，特别是3岁以下的儿童，其产生抗体往往要更久，而且产生抗体的水平也较低，若检测的是抗体，则不能很好地区分既往感染和急性感染。因此抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药指导比抗体法更有优势。2021/4/2723病原体抗体检测病原体抗原检测检测最佳时间一般在感染一周左右病毒感染出现症状后即可检测出临床意义回顾性诊断，适用于疾病后期的诊断，多用于循证医学疾病早期诊断对患者的治疗有重要指导意义检测灵敏度不能很好地检测变异的病毒将多种抗体进行组合，能更好地应对变异的病毒检测方法一般使用酶联免疫或间接免疫荧光法，有非特异性荧光一般用直接免疫荧光法，几乎无非特异性反应2021/4/2724人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
