1、2.DNA重组技术与基本操作重组技术与基本操作基因工程基因工程1.1.基因工程概况基因工程概况2.DNA2.DNA重组与工具酶重组与工具酶 3.3.基因克隆载体基因克隆载体4.4.目的基因目的基因5.5.重组重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞6.6.重组子的鉴定重组子的鉴定第一节第一节 基因工程概况基因工程概况一、基因工程的基本概念一、基因工程的基本概念 1.基因基因(gene):是是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列总称，是遗传物质的最小功能单位。列总称，是遗传物质的最小功能单位。2.重组重组DNA技术技术:u是指将一种生物体（是指将一种生
2、物体（供体供体）的基因与）的基因与载体载体在体外在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的物或新性状的DNA体外操作程序，也称为体外操作程序，也称为分子克分子克隆技术隆技术。因此，因此，供体供体、受体受体、载体载体是重组是重组DNA技术的技术的三大基本元件三大基本元件3.基因工程：基因工程：是是指重组指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括技术的产业化设计与应用，包括上游上游技术技术和和下游技术下游技术两大组成部分。两大组成部分。上游技术上游技术指的是基
3、因重组、克隆和表达的设计与指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组构建（即重组DNA技术）；技术）；下游技术下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的核心是构建重组体基因工程的核心是构建重组体DNADNA的技术，所以的技术，所以基因工程和重组基因工程和重组DNADNA技术有时也就成为技术有时也就成为同义词同义词。二、基因工程研究的理论依据是：二、基因工程研究的理论依据是：1.不同基因具有相同的物质基础：不同基因具有相同的物质基础：不同生物的基因不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以互
4、换的。片段）原则上是可以互换的。2.基因是可以切割的基因是可以切割的 3.基因是可以转移的，而且是可以重组的基因是可以转移的，而且是可以重组的4.多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系 5.遗传密码是通用的遗传密码是通用的6.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代三、基因工程的基本过程：三、基因工程的基本过程：（一）基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：（一）基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：1.分离或合成基因（分离或分离或合成基因（分离或PCR）。）。2.通过体外重组将基因插人载体（由病毒、质粒或染色体通过体外重组将基因插人载体
5、（由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体）片段构建成的载体）;3.将重组将重组DNA导人细胞（微生物、植物或动物）导人细胞（微生物、植物或动物）;4.扩增克隆的基因扩增克隆的基因;5.筛选重组体克隆，对克隆的基因进行鉴定或测序筛选重组体克隆，对克隆的基因进行鉴定或测序;6.控制外源基因的表达控制外源基因的表达;7.得到基因产物或转基因动物、转基因植物得到基因产物或转基因动物、转基因植物.一个典型的一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个重组实验通常包含以下几个步骤步骤：提取供体生物的提取供体生物的目的基因目的基因(或称或称外源基因外源基因)，酶解连接到另，酶解连接到另一一DNA分子上分子上
6、(克隆载体克隆载体)，形成一个新的，形成一个新的重组重组DNA分子；分子；将这个重组将这个重组DNA分子分子转入转入受体细胞并在受体细胞中复制受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为保存，这个过程称为转化转化(transformation)；对那些吸收了重组对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行的受体细胞进行筛选筛选和和鉴定鉴定；对含有重组对含有重组DNA的细胞进行大量的细胞进行大量培养培养，检测检测外源基因是外源基因是否表达。否表达。（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上游操作的基本过程（1）从供体细胞从供体细胞中分离出基因组中分离出基因组DNA，用，用限制性限制性核酸内切酶核酸
7、内切酶分别分别将外源将外源DNA（包（包括外源基因或目括外源基因或目的基因）和载体的基因）和载体分子切开（简称分子切开（简称“切切”）；）；（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上游操作的基本过程（2）用）用DNA连接酶将含有连接酶将含有外源基因的外源基因的DNA片断接到片断接到载体上，形成载体上，形成DNA重组分子重组分子（简称（简称“接接”）；）；（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上游操作的基本过程（3）借助于）借助于细胞转化手段细胞转化手段将将DNA重组分重组分子导入受体细子导入受体细胞中（简称胞中（简称“转转”）；）；（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上
8、游操作的基本过程（4）短时间培）短时间培养转化细胞，以养转化细胞，以扩增扩增DNA重组分重组分子或使其整合到子或使其整合到受体细胞的基因受体细胞的基因组中（简称组中（简称“增增”）；）；（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上游操作的基本过程（5）筛选和鉴）筛选和鉴定转化细胞，获定转化细胞，获得使外源基因高得使外源基因高效表达的基因工效表达的基因工程菌或细胞（简程菌或细胞（简称称“检检”）；）；（二）基因工程上游操作的基本过程（二）基因工程上游操作的基本过程 由此可见，基由此可见，基因工程的上游因工程的上游操作过程可简操作过程可简化为：化为：“切、接、切、接、转、增、检转、增、检”五五
9、步；步；四、四、基因工程的四大要素基因工程的四大要素1 基因工程工具酶和基因工程工具酶和DNA加工加工 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 连接酶连接酶 末端修饰酶末端修饰酶 等等 2 基因克隆载体基因克隆载体 常用载体：质粒和病毒常用载体：质粒和病毒 等等3 目的基因目的基因 简单的说目的基因就是能表达优良性状的基因。简单的说目的基因就是能表达优良性状的基因。4 受体细胞受体细胞五五 基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术细菌转化转染技术 DNA序列分析技术序列分析技术 寡核苷酸合成技术寡核苷酸合成技术 基因定
10、点突变技术基因定点突变技术 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）技术）技术六、重组六、重组DNA技术技术与基因工程的基本用途与基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 设计、构建生物的新性状甚至新物种设计、构建生物的新性状甚至新物种 大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性物质第二节第二节 DNA重组重组与工具酶与工具酶 1 DNA2 基因工程的工具酶基因工程的工具酶3 DNA片段的连接重组片段的连接重组一一、DNAl 核酸组成核酸组成l 核酸的分类核酸的分类l 四种碱基四种碱基l 核酸的功能核酸的功能 能携带遗传信息能携带遗传信息
11、DNA分子能在细胞内复制分子能在细胞内复制 DNA分子可转录合成分子可转录合成RNA mRNA翻译合成蛋白质翻译合成蛋白质bp、kb、Mb：一个双链一个双链DNA分子的长度通常用分子的长度通常用互补核苷酸对的互补核苷酸对的数目数目来表达，也就是通常所说的碱基对来表达，也就是通常所说的碱基对(base pair,bp)。对于大的对于大的DNA分子通常用多少千个碱基对来表示，分子通常用多少千个碱基对来表示，即即kb(kiIo base pairs)。当双链当双链DNA分子超过几百万个诚基对时，就用百分子超过几百万个诚基对时，就用百万碱基对，即万碱基对，即Mb(mega base pairs)这个单
12、位来这个单位来描述它。描述它。二二 基因工程的工具酶基因工程的工具酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶（一）（一）限制性内切核酸酶（限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）：）：简称简称限制酶限制酶。限制酶能够识别。限制酶能够识别DNA大分子链上大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位将特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位将DNA断裂。断裂。它的发现和应用为从细胞基因组中分离目的基因它的发现和应用为从细胞基因组中分离目的
13、基因提供了重要工具。提供了重要工具。1 限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现 1962年年 Arber,W(瑞士瑞士).等等 提出限制与修饰假说。提出限制与修饰假说。1968 Arber 等发现等发现型限制性酶。型限制性酶。1968 Smith和和Wilcox K.W.发现了发现了类限制性酶类限制性酶 并阐明其性质。并阐明其性质。1971 Nathans等首次制作酶切图谱。等首次制作酶切图谱。因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。年度诺贝尔生理学和医学奖。1962,Arber,1968 Smith 发现限制
14、性酶 W.Arber(1929)H.O.Smith(1931)Biozentrum der Universitt Basel,Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA 2 限制性核酸内切酶的生物功能限制性核酸内切酶的生物功能识别识别双链双链DNA分子中的特定序列，并分子中的特定序列，并切割切割DNA双链双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵的入侵 细菌的细菌的限制与修饰作用限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限
15、制性甲基化酶：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出株中分离出Hind II和和Hind III 3 3 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名 属名属名 种名种名 株名株名H i n d H i n d IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶4 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型5 II 型限制性核酸内切酶的基本
16、特性型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链识别双链DNA分子中分子中4-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构EcoRI等产生的等产生的5粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-G
17、A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPOHPPstI等产生的等产生的3 粘性末端粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHPPvuII等产生的等产生的平头平头末端末端5 G-C-T-C-
18、A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 同裂酶同裂酶（Isoschizomers)：有一些来源不同的限制性内：有一些来源不同的限制性内切酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同切酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶，如裂酶，如Hpa和和MspMsp，BamHBamH I I和和BstBst I I分别是一对同分别是一对同裂酶。裂酶。产生同样的切刻，形成同样的末端产生同样的切刻，形成
19、同样的末端 同尾酶同尾酶(Isocaudamer)：与同裂酶对应的一类核酸限制：与同裂酶对应的一类核酸限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶子序列也各不性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，特称之为同尾酶。相同，但都产生出相同的粘性末端，特称之为同尾酶。如如BamH,BclBcl,BglBgl,Sau3ASau3A和和XhoXho是一组同尾是一组同尾酶。酶。6 影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素1）DNA样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等等 加大酶的用量，
20、加大酶的用量，1 mg DNA 用用 10U 酶酶 加大反应总体积加大反应总体积 延长反应时间延长反应时间2）DNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的dam甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌序列中的腺嘌呤呤N6位引入甲基，受其影响的酶有位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dam甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG3或或5CCTGG3序列中的胞嘧啶序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影位上引入甲基，受其影响的酶有响的酶有EcoR I等等 哺乳动物中的甲基化酶在
21、哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的序列中的C5位上引入位上引入甲基甲基3）核酸内切酶的缓冲液性质：）核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的发生低特异性，即所谓的Star activity现象。现象。如：如：EcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者或者5AATT34）核酸内切酶
22、的反应温度：）核酸内切酶的反应温度：反应体系的温度是否是内切酶的最适反应温度。反应体系的温度是否是内切酶的最适反应温度。7 限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切DNA的方法的方法 单酶切单酶切（完全酶切完全酶切）环形环形DNA：酶切后产生与识别序列数相同的：酶切后产生与识别序列数相同的DNA片段，片段，且片段的两个末端相同。且片段的两个末端相同。线形线形DNA片段：产生片段：产生n+1个个DNA片段数，且有两个片片段数，且有两个片段的一端仍保留原来的末端。段的一端仍保留原来的末端。双酶切双酶切（完全酶切完全酶切）：两种不同的）：两种不同的RE切同一种切同一种DNA分子。分子。酶切结果？线形酶切结果
23、？线形DNA分子，环形分子，环形DNA分子，同尾酶分子，同尾酶7 限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切DNA的方法的方法 部分酶切部分酶切：RE对识别序列的不完全酶切原因有底物DNA的纯度、识别序列的甲基化、酶的用量不足、反应时间不够、反应缓冲液和温度不适宜等。8 类型类型限制性内切酶的主要用途限制性内切酶的主要用途1）制作）制作DNA分子的物理图谱；分子的物理图谱；练习：练习：根据以下描述绘制限制性内切酶图谱根据以下描述绘制限制性内切酶图谱 现分离到某现分离到某DNA片段，用片段，用BglII 和和 BamHI 酶切后进行电泳酶切后进行电泳检测，得到如下的电泳图。请根据电泳结果分析检测，得到如下
24、的电泳图。请根据电泳结果分析BglII 和和 BamHI在该在该DNA片段上的位置。要求标注酶切位点及各片片段上的位置。要求标注酶切位点及各片段的长度。段的长度。2）产生新的嵌合）产生新的嵌合DNA分子（分子（DNA的连接）的连接）（二）（二）DNA连接酶连接酶1 定义定义：利用利用ATP 或或NAD+作为作为能量能量，通过催化并排的两，通过催化并排的两条条DNA片段的片段的5-P，3-0H之间形成一个磷酸二酯之间形成一个磷酸二酯键，从而使两段键，从而使两段DNA分子共价连接起来的特异的分子共价连接起来的特异的酶称酶称DNA连接酶。连接酶。或或：DNA连接酶（连接酶（Ligase）是一种能够催
25、化在双）是一种能够催化在双股股DNA链的链的3-OH和和5-P之间形成磷酸二酯键的之间形成磷酸二酯键的酶。酶。注意：注意：DNA连接酶并不能连接两条单链的连接酶并不能连接两条单链的DNA分子或环分子或环化的单链化的单链DNA分子，被连接的分子，被连接的 DNA链必须是双链必须是双螺旋螺旋DNA分子的一部分。分子的一部分。可连接互补粘性末端或平末端以及缺口修复，不可连接互补粘性末端或平末端以及缺口修复，不能连接单链能连接单链DNA或裂口或裂口裂口裂口（Gap）：单链的裂口，是双链）：单链的裂口，是双链DNA分子上分子上某一条链失去一个或连续数个核苷酸所造成的单某一条链失去一个或连续数个核苷酸所造
26、成的单链断裂，称链断裂，称DNA的的Gap。缺口缺口（Nick）：是双链）：是双链DNA分子上的单链断裂，分子上的单链断裂，是由相邻两个核苷酸之间失去磷酸二酯键所造成是由相邻两个核苷酸之间失去磷酸二酯键所造成的单链断裂，称的单链断裂，称DNA的的Nick。2 DNA连接酶的三个条件：连接酶的三个条件：需能过程，即需要需能过程，即需要ATP；（；（2个高能磷酸键）个高能磷酸键）被连接的两个片段，一端要提供游离的被连接的两个片段，一端要提供游离的5-P，另，另一端提供游离的一端提供游离的3-OH；5-P与与3-OH的并排。的并排。3 DNA连接酶的基本作用连接酶的基本作用1 1）修复双链）修复双链
27、DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick2 2）修复与）修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C
28、-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 53 3）连接多个平头双链）连接多个平头双链DNADNA分子分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶连接酶平头双链平头双链DNA片段的连接操作片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于造的粘性末端的连接属于分子内部分子内部的连
29、接，而平的连接，而平头末端的连接则属于头末端的连接则属于分子间分子间的连接，因此后者反的连接，因此后者反应速度要慢得多应速度要慢得多平末端平末端DNA的连接方法：的连接方法：1）直接利用）直接利用T4 DNA 连接酶连接连接酶连接2）另外的常用方法：）另外的常用方法：同聚物加尾；同聚物加尾；linker（衔接物）连接法；（衔接物）连接法；加加Adapter方法（接头）。方法（接头）。提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用加大连接酶用量量（10倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端加大平头末端底物的浓度底物的浓度，增加分子间碰撞机会，增加分
30、子间碰撞机会 加入加入10%PEG8000(聚乙二醇）聚乙二醇），促进大分子之，促进大分子之间的有效作用间的有效作用 加入加入单价阳离子单价阳离子（NaCl），最终浓度），最终浓度150-200 mM（三）（三）DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应反应特点反应特点：1）以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成为底物催化合成DNA2）需要模板需要模板(3 5)、Mg2+和引物的存在和引物的存在3）不能从头合成新的不能从头合成新的DNA链（链（必须有必须有3 -OH末端末端）4）催化催化dNTP加到生长中的加到生长中
31、的DNA链的链的3-OH末端末端5）催化催化DNA合成的方向是合成的方向是5 3 6）产物）产物DNA的极性与模板相对。的极性与模板相对。5种：种：DNA聚合酶聚合酶 I、II、III、1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I（DNA pol I）5353的的DNA聚合酶活性聚合酶活性5353的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性3535的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I 的基本性质：的基本性质：3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OH5 ppp dN Mg2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G
32、-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNA pol I缺口平移标记法缺口平移标记法2）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I 的基本用途：的基本用途：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（a a-32P-dATP）5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 制备制备
33、32P标标记的探针记的探针DNase IDNA pol I2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I 大片段（大片段（Klenow）大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理，经枯草杆菌蛋白酶处理，获得的三分之二的大肽段，即为获得的三分之二的大肽段，即为Klenow酶酶 Klenow酶仍拥有酶仍拥有53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸的核酸外切酶活性外切酶活性Klenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的3隐蔽末端隐蔽末端 DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记
34、cDNA第二链的合成第二链的合成 双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNA序列序列Klenow酶酶补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 Klenow酶的基本用途：酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 G-C-T-G-OH
35、 P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa a-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 3 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以RNA为模板聚合为模板聚合cDNA链链3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA反转录酶反转录酶Mg2+dNTP5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-183AA
36、AAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTTTT3cDNA（四）核酸外切酶（四）核酸外切酶 单链核酸外切酶：单链核酸外切酶：核酸外切酶核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要不需要Mg2+（四）核酸外切酶（四）核酸外切酶 双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从特异性地从3 端外切端外切 双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：核酸外切酶（核酸外切酶（Exo）核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 端外切端外切（五）单链核酸内切酶：（五）单链核
37、酸内切酶：S1核酸酶核酸酶S1核酸酶的基本特性：核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）降解降解单链单链DNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNA快快75000倍倍 Zn2+必需必需 最适最适pH范围为范围为4.0-4.3 需要需要NaCl 10-300 mmol/L 降解单链降解单链DNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNA快快7倍倍S1核酸酶的主要功能：核酸酶的主要功能：S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切单链内切单链DNA或或RNA5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3S1Zn2+5 G-
38、C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 35 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 35 dNMPs 或或 5 NMPsS1核酸酶的主要功能：核酸酶的主要功能：S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链内切带缺口或缺刻的双链DNA或或RNA5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5 nickgapS1Zn2+5 G-C-T-C-
39、A-G3 C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T 3A-C-C-T-C-A 5 S1核酸酶的重要核酸酶的重要用途用途：在：在DNA上定位上定位RNA（S1 mapping）DNAmRNA杂交杂交S1EcoRI（六）（六）末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）TdT的基本特性：的基本特性：来自小牛胸腺来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的DNA聚合酶聚合酶(53)，随机掺入随机掺入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTMg2+dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 TdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+d
40、ATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+dTTP5 p3 HOTTTTTTTTTTTTTTTT OH 3 p 5 TTTTTTT TTTTTT来自小牛肠的碱性磷酸单酯酶（来自小牛肠的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N（七）七）碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶脱掉脱掉5磷酸基团磷酸基团T4-PNP的基本特性：在的基本特性：在DNA、R
41、NA的的5-OH上加磷酸基上加磷酸基5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+pppATP（g g-32P-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末端同位素标记：（八）（八）T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）小结：二小结：二 基因工程的工具酶基因工程的工具酶 限制性内切酶限制性内切酶 DNA连接酶连接酶 DNA聚合酶聚合酶 核酸外切酶核酸外切酶 单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1核酸酶核酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）碱性磷酸酶碱性磷酸酶 T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP
42、）三 DNA片段的连接重组 DNA连接酶连接酶 DNA片段之间的连接片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接具平末端具平末端DNA片段之间的连接片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行的连接片段末端修饰后进行的连接DNA片段加连杆后进行连接片段加连杆后进行连接 DNA重组重组同种内切酶产生的粘性末端的连接同种内切酶产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTT
43、AA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCA
44、CTAGG5 5GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 5突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555
45、 AATTC GT4-DNA ligase5 5Klenow补平补平Klenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGT
46、TAAG退火退火BamH IBamH IEcoR IBamH I人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 3突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCG
47、TACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 平头末端平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTT
48、GCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更换粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoR IGG
49、AATTCCCCTTAAGGEcoR I linker 重组率重组率 重组率重组率=含有外源含有外源DNA的重组分子数的重组分子数/载体分子总数载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化可以大大简化DNA重组的后续操作。重组的后续操作。DNA重组重组重组率的定义重组率的定义提高重组率的方法提高重组率的方法提高外源提高外源DNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5:1-10:1 载体载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸
50、基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶提高重组率的方法提高重组率的方法加装同聚尾末端：加装同聚尾末端：CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGG
