1、目目 录录 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy目目 录录目目 录录一、一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是的方法。基因诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽。，也可以是蛋白质或者多肽。目目 录录目目 录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或蛋白质水平变
2、化，如病毒基因及或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；从低到高；l基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。目目 录录目目 录录基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性目目 录录目目 录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）n聚合酶链式
3、反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）nDNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）n生物芯片（生物芯片（biochips）nWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 目目 录录目目 录录单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的同，变性为单链
4、后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。目目 录录目目 录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意目目 录录目目 录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 目目 录录目目 录录 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism,RFLP）由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸
5、内切酶消化时产生不同位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。目目 录录目目 录录 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩扩增后用该限制酶切割增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLP目目 录录目目 录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoR
6、限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化目目 录录目目 录录DNA序列测定序列测定(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法)目目 录录目目 录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究目目 录录目目 录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图目目 录录目目 录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCP
7、SSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片目目 录录目目 录录基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传
8、标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。目目 录录目目 录录（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：被检测基因变化与疾病发生有被检测基因变化与疾病发生有直接因果直接因果关系关系 被检被检基因正常分子结构已被确定基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的被检基因致病的分子机制分子机制（突变位点或表达变（突变位点或表达变化）已知化）已知目目 录录目目 录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位
9、点改变目目 录录目目 录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 目目 录录目目 录录 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。征）等。2.2.基因重排的
10、检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 目目 录录目目 录录BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血目目 录录目目 录录 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）目目 录录
11、目目 录录3.基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析目目 录录目目 录录（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病致病基因未知基因未知或基因结构不确定或基因结构不确定致病突变致病突变机制不清机制不清致病致病位点不便检测位点不便检测目目 录录目目 录录 DNA多态性：多态性：指群体中的指群体中的DNA分子存分子存在至少两种不同的类型，即在至少两种不同的类型，即个体间同一染色个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。或变异
12、。多在进化中形成，本身并不致病，只是多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记目目 录录目目 录录间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)目目 录录目目 录录7.6kb13kb患患者者正正常常
13、 HBS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针目目 录录目目 录录 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases目目 录录目目 录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（
14、二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断 三、脆性三、脆性X综合征综合征 目目 录录目目 录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 目目 录录目目 录录n正常正常的（的（N）的）的ASO探针：探针：5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变突变的（的（M）的）的ASO探针：探针：5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰
15、状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法目目 录录目目 录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子5 3 正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)5 3 突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS的的限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析目目 录录0.2kb1.1
16、5kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目 录录目目 录录目目 录录3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker目目 录录目目 录录1.PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密
17、码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I;1:未酶解片段；未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症目目 录录目目 录录-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.2.反向斑点杂交反向斑点杂交目目 录录目目 录录二、血友病（二、血友病
18、（Hemophilia）n甲型血友病是由于血浆凝血因子甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。）缺陷造成。n甲型血友病的基因突变类型已有甲型血友病的基因突变类型已有300余种，余种，其中点突变占其中点突变占174种；另有部分患者是由于种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。的基因倒位所致。目目 录录目目 录录1.FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印迹分析印迹分析 将基因组将基因组DNA用用Nco I，Dra I或或Bcl I等内切酶等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针
19、进行杂交分析，正常人表现为杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和和16 kb三种三种类型。类型。I型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、17.5和和14 kb三种类型；三种类型；型倒位患者表现为型倒位患者表现为20、16和和15.5 kb三种带型。在三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。目目 录录目目 录录2.FVIII基因突变的检测基因突变的检测（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析的连锁分析（2）RFLP连锁分析连锁分析（3）VNTR分析分析（4）短串联重复序列（
20、）短串联重复序列（STR）的连锁分析）的连锁分析目目 录录目目 录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性 X 智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定的定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。岛的异常甲基化。n正常人中约为正常人中约为 850 拷贝。拷贝。n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG 岛岛未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突变（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的
21、女性中，达到2001000拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。）。n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1 mRNA在在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。目目 录录目目 录录脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用基因诊断方法1PCR-ASO 2DNA连锁分析连锁分析 3Souhern印迹杂交法印迹杂交法4PCR扩增扩增 感染病的基因诊断感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Dis
22、eases目目 录录 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）HAV系系RNA病毒，利用病毒，利用RT-PCR技术可从粪便技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）设计保守区序列引物，扩增各型设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。，以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）HCV为正链为正链RNA病毒，先反转录成病毒，先反转录成cDNA，再，再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。目目
23、录录目目 录录目目 录录二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病n结核分枝杆菌结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一技术扩增出一383 bp序列，再用探针序列，再用探针杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）主要采用主要采用PCR技术：检测技术：检测HP染染色体色体DNA特异片段；检测特异片段；检测HP尿素酶尿素酶A基因；用基因；用PCR-RFLP鉴别鉴别HP菌株。菌株。目目 录录目目 录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫 n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫n衣原体感染衣原体感染
24、诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术 目目 录录目目 录录肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测原癌基因的检测 ras 基因家族基因家族由由H-ras、K-ras和和N-ras组成。最常见组成。最常见的突变是第的突变是第12、13、59或第或第61位密码子的位密码子的点突变点突变
25、。胰腺癌、结肠癌、肺癌胰腺癌、结肠癌、肺癌以以K-ras突变为主，如第突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为突变为TGT、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；突变为主；泌尿系统肿瘤泌尿系统肿瘤则以则以H-ras突变为主。突变为主。目目 录录目目 录录 PCR 及及PCR-SSCP分析：分析：扩增扩增ras 基因第基因第12位密码子点突变部位，再用位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分技术进行分析，或者直接测序确定患者析，或者直接
26、测序确定患者ras原癌基因的点突原癌基因的点突变。变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变。位密码子点突变。2.ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法目目 录录目目 录录3抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测 np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术分析技术 （2）DNA序列分析序列分析 （3）PCR-RFLP分析分析基因诊断在法医学上的应基因诊断在法医学上的应用用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目 录录目目 录录目目
27、 录录n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。在人群中存在变异，形成多态性。n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。n重复单位重复单位625 bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。重复单位重复单位26 bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNA。一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与多态性遗传标记目目 录录目目 录录人类人类DNADNA指纹图指纹图目目 录录目目 录录二、二、
28、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个体识别和亲子鉴定：个体识别和亲子鉴定：DNA指纹技术是从指纹技术是从基因水平检测基因水平检测DNA的高度多态性，个体识的高度多态性，个体识别率高。别率高。n以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型，分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。一认证。基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目目 录录n基因治疗：基因治疗：指将目的基因通
29、过基因转移指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。的基因表达产物对疾病起治疗作用。目目 录录 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。广义基因治疗：广义基因治疗：外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物外源正常基因导入病变细胞，产生正常
30、基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。治疗疾病的目的。目目 录录目目 录录基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somatic cell)基基因治疗因治疗生殖细
31、胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代目目 录录目目 录录 一、基因治疗的基本方法一、基因治疗的基本方法目目 录录 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacement）定义：定义：将特定目的基因导入特定细胞将特定目的基因导入特定细胞，通过定，通过定位重组，导入的位重组，导入的正常基因正常基因，以，以置换置换基因组内原有基因组内原有的的缺陷基因缺陷基因。目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常
32、序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。涉及基因组的任何改变。目目 录录n定向整合的条件定向整合的条件:转导基因的载体与基因组转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列具有相同的序列。带有目的基因的载体。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。列的交换。n基因基因同源重组同源重组技术又称为技术又称为基因打靶基因打靶(gene targeting）n细胞内基因同源重组的发生率很低。细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术基因同源重组技术目目 录录
33、（二）（二）基因基因增补增补（gene augmentation）定义定义:通过通过导入外源基因导入外源基因使靶细胞表达其本身使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型:n有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。目目 录录（三）基因干预（三）基因干预（gene int
34、erference）定义：定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。以达到治疗疾病的目的。目目 录录n定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这基因导入宿主细胞中，这种基因编码的种基因编码的酶酶能使无毒性的药物前体转化能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。从而达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。是恶性肿瘤基因治疗的主要
35、方法。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy)目目 录录 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。目目 录录 基因转移基因转移(gene transfer)技术技术 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移目目 录录 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，因介导的基因转移效率较高，因此它也
36、是使用最多的基因治疗载体。据统计，此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的病例使用了的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体体。目目 录录反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 目目 录录 （2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在
37、染色然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。目目 录录目目 录录腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口
38、服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。外源基因。目目 录录目目 录录 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。l靶向性差。靶向性差。l不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增中。分裂增殖殖 快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。而丢失的机会增多，表达时间相对较短。目目 录录目目 录
39、录常用基因治疗载体常用基因治疗载体 整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反转录病毒反转录病毒 载体载体随机整合，效随机整合，效率高率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺病毒载体腺病毒载体不整合，可能不整合，可能丢失丢失不致病不致病分裂细胞、非分裂细胞、非分裂细胞分裂细胞 腺相关病毒载腺相关病毒载体体定点整合定点整合(1919号号染色体特定区域染色体特定区域)不致病不致病分裂细胞、非分裂细胞、非分裂细胞分裂细胞5kb5kb7.5kb7.5kb目目 录录 2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技
40、术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNA混合混合后，可以自动形成包埋外源后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图目目 录录目目 录录（2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，与细胞或组织亲和性的配体偶联
41、，可使可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的用与带负电荷的DNA结合，将结合，将DNA包围，只包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源源DNA导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图目目 录录目目 录录 （3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要
42、进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。n将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏壁内毛细血管增加30%40%；n将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；的胰岛素；
43、n肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子。目目 录录 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点p制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容重组体的技术较容易；易；p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；逆转的缺点；p基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒
44、载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。目目 录录三、基因干预三、基因干预 （gene interference）目目 录录（一）反义（一）反义RNA（antisense RNA）1.反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质
45、粒，将这的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。目目 录录2.受体介导反义受体介导反义RNA技转移术技转移术 受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被转移的被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。的核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因转移方法借助前述的受体介导基因转移方法，可可以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移。转移。目目 录录 3.反义反义RNA的优点的
46、优点 受体介导的反义受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l）安全性高）安全性高 （2）反义）反义RNA设计和制备方便设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNA病毒病毒目目 录录（二）核酶（二）核酶 (ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分
47、子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶将靶RNA分子切断，通过破坏靶分子切断，通过破坏靶RNA分子而达分子而达到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。核酶锤头状的二级、三级结构核酶锤头状的二级、三级结构 只要两个只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（序列（13个或个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。上方产生剪切反应。目目 录录目目 录录 1.核酶的设计核
48、酶的设计 核酶是通过靶核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。酶。（1 1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列构域），两端是引导序列。目目 录录目目
49、 录录核酶的作用机制核酶的作用机制 目目 录录 2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，酶的攻击。更重要的是，核酶在切断核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的重新结合和切割其它的mRNA分子。分子。目目 录录（三）干扰（三）干扰RNA 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干扰干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双是一种由双链链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链诱发的基因沉默现象。在此过程
50、中，与双链RNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从被降解，从而抑制该基因的表达。有义而抑制该基因的表达。有义RNA（sense RNA）或反或反义义RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，均能抑制线虫基因的表达，双链双链RNA比单链比单链RNA更为有效。这与传统上对反义更为有效。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义效率比反义RNA至少高至少高2个数量级。个数量级。目目 录录 2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤：（1）小干扰性）
