1、中国药科大学药物分析教研室第六章第六章vChemical structure&featurevIdentificationvDetection of specific impurities in Analysis of Aromatic carboxylic acids&estersvAssay Aspirin,Sodium aminosalicylate&Clofibrate中国药科大学药物分析教研室 Aromatic carboxylic acids水杨酸类COOHOR水杨酸 SAsalicylic acid COOHOH阿司匹林aspirinCOOHOCOCH3对氨基水杨酸钠PAS-Na
2、COONaOHNH2贝诺酯benorilate OCOCH3COONHCOCH3双水杨酯salsalateCOOHOCOOH中国药科大学药物分析教研室COOHRR 苯甲酸类HOCOOC2H5羟苯乙酯ethylparobenCOOH(CH3CH2CH2)2NSO2丙磺舒 probenecidCOOH苯甲酸benzoic acid甲芬那酸 mefenamic acidCOOHNH HCH3CH3COONasodium benzoate中国药科大学药物分析教研室COOHRRR 其他芳酸类ClOCCH3CH3COOC2H5氯贝丁酯clofibrate布洛芬ibuprofenCHCH2CHCH3CH3C
3、OOHCH3中国药科大学药物分析教研室 特点特点均有均有苯环、羧酸或其酯苯环、羧酸或其酯水杨酸类和苯甲酸类结构中的羧基直水杨酸类和苯甲酸类结构中的羧基直接与苯环相连接与苯环相连除了酸性基团外，各自具有本身的官除了酸性基团外，各自具有本身的官能团能团分子中苯环、羧酸和取代基的相互影响，分子中苯环、羧酸和取代基的相互影响，使芳酸的酸性强度各有不同使芳酸的酸性强度各有不同中国药科大学药物分析教研室COO-COO-OHCOO-SO2N(C3H7)2OCOO23FeFe紫堇色COOOOCFe3(OH)26赭色COO(C3H7)2NSO23Fe米黄色pH5.06.0T.S.FeCl3pH46中性溶液鉴别三
4、氯化铁反应三氯化铁反应中国药科大学药物分析教研室COONa73FeCl32OH-中性溶液COO6Fe3(OH)2OOC7NaCl2Cl-碱式苯甲酸铁盐（赭色沉淀赭色沉淀）加稀HCl，沉淀分解，生成游离COOH白色中国药科大学药物分析教研室RCNOOHFe/3Fe3+紫色RCNOOHHH2NOHN NNHOCHNCN N(DCC)RCOHORCOOCNN NNH布洛芬NHCNOCRO中国药科大学药物分析教研室 重重氮化偶合反应氮化偶合反应具体方法见芳香胺类药物的鉴别 氧化反应氧化反应 异羟肟酸铁反应异羟肟酸铁反应甲芬那酸甲芬那酸H2SO4深蓝色深蓝色(O)K2Cr2O7并产生绿色荧光绿色荧光随即
5、变为棕绿色棕绿色中国药科大学药物分析教研室ClOCCH3CH3COOC2H5+NH2OH HCl+2KOHClOCCH3CH3CONHOK+C2H5OH+H2O+KClFe3+H+ClOCCH3CH3CONHOFe/3紫色中国药科大学药物分析教研室 水解产物的反应水解产物的反应HOOCSO2N(CH2CH2CH3)2NaOHONa+CO2+Na2SO3+HNC3H7C3H7HNO3Na2SO4 分解产物的反应分解产物的反应 UV特征吸收特征吸收 IR吸收光谱吸收光谱中国药科大学药物分析教研室v特殊杂质的由来与方法检查特殊杂质的由来与方法检查Acetyl Salicylic AcidONaCO2
6、加压，ONaCOONaOHCOOHH+OH-CO2副产物SACOOHOCOCH3(CH3CO)2OH2SO4,7075 C。ASA Aspirin中国药科大学药物分析教研室SA溶液的澄清度溶液的澄清度酚类和酯类升华精制时温度过高制备过程中未反应完全SASA产生脱羧副反应苯酚来源其他副反应产生酯类中国药科大学药物分析教研室易碳化物炽灼残渣重金属中国药科大学药物分析教研室 PAS-Na中国药科大学药物分析教研室 羟苯乙酯羟苯乙酯 供试品自身对照法供试品自身对照法BPBP（19981998）反相反相TLC TLC 高低浓度对比法高低浓度对比法 取羟苯乙酯丙酮液取羟苯乙酯丙酮液1.0%1.0%和和0.
7、01%0.01%，2 2ulul，254nm254nm查荧光，前一查荧光，前一个任何第二个斑点的大小和强度个任何第二个斑点的大小和强度不应超过后一个。不应超过后一个。中国药科大学药物分析教研室 a.a.杂质对照品法杂质对照品法 方法：方法：供试品供试品供试品溶液供试品溶液杂质对照品杂质对照品对照品溶液对照品溶液 中国药科大学药物分析教研室供供试试品品对对照照品品中国药科大学药物分析教研室 判断：供试品中所含杂质斑点判断：供试品中所含杂质斑点不得超过相应的杂质对照斑点。不得超过相应的杂质对照斑点。优点：同一物质，同一优点：同一物质，同一R Rf f值比值比较，准确度高、直观性强。较，准确度高、直
8、观性强。缺点：需要杂质对照品。缺点：需要杂质对照品。中国药科大学药物分析教研室 b.b.高低浓度对比法高低浓度对比法 方法：方法：对照溶液一定量供试品溶液供试品溶液稀释溶剂溶解 S中国药科大学药物分析教研室供试品对照品中国药科大学药物分析教研室 判断：判断：供试品溶液所显杂质斑点供试品溶液所显杂质斑点不得深于对照溶液的主斑点（或不得深于对照溶液的主斑点（或荧光强度）荧光强度）控制杂质斑点个数，控制控制杂质斑点个数，控制杂质种类杂质种类中国药科大学药物分析教研室 氯贝丁酯氯贝丁酯对氯酚（0.0025%）挥发性杂质（0.5%）GC法5%SE-30 2m160，N2FID 杂质以归一化法求得中国药科
9、大学药物分析教研室v含量测定含量测定 Acid-base titration method 以以ASA及其制剂为例及其制剂为例苯甲酸pKa 4.20 水杨酸pKa 2.98酸性较强COHOHO因此，可采取直接滴定法直接滴定法中国药科大学药物分析教研室pKa 36 的药物溶于中性醇,可直接用直接用NaOH滴滴定定pKa 69 的药物要用非水溶液滴定法非水溶液滴定法中性乙醇COOHOCOCH3NaOH20以下COONaOCOCH3H2O中性乙醇：对指示剂中性乙醇：对指示剂(酚酞酚酞)而言为中性，而言为中性，可消除滴定误差可消除滴定误差乙醇作用：溶解乙醇作用：溶解ASA；防止防止ASA在水溶在水溶
10、液中滴定过程易水解液中滴定过程易水解本法特点：简单Aspirin 丙磺舒(Ch.P.BP.JP等)苯甲酸(Ch.P等)均采用本法中国药科大学药物分析教研室 Residual titration after hydrolysisUSP23方法：取本品约1.5g，精密称定，准确加NaOH液(0.5mol/L)50.0ml，水浴上煮沸15min，放冷，以酚酞为指示剂，用H2SO4液(0.25mol/L)滴定剩余剩余的NaOH，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的NaOH液(0.5ml/L)相当于45.04mg的C9H9O4中国药科大学药物分析教研室剩余滴定时消耗酸量 (ml)同时做空白试验，消耗酸
11、量 (ml)Ch.P 00羟苯乙酯的Assay亦采用OCOCH3COOH2NaOHH2OOHCOONaCH3COONabBaA2NaOH H2SO4 Na2SO4 2H2O中国药科大学药物分析教研室反应物质之间的化学计量关系aA+bBcC+dD被测物滴定液毫摩尔数(g/mol)(g)毫摩尔质量BWnBB(g/mol)(g/mol)(g/mol)毫摩尔质量毫摩尔质量毫摩尔质量BVMab Bnab BnWAAABB nban BAMVnAABnabn 中国药科大学药物分析教研室滴定度计算滴定度计算mg04.45g04504.020002.180 MT0.51001)(%ASA0WMMV-VT规定测
12、MVMTW100125.0)(04504.00WMV-V规定的硫酸浓度为0.25mol/L1000ASA21ASANaOHNaOHWVMTab毫摩尔质量中国药科大学药物分析教研室 Two-step titration用于Aspirin片测定片剂中有稳定剂水解产物水杨酸SAHAcHOCCOOHCH2COOHCH2COOH枸橼酸Citric acidHOCHCOOHCHCOOHHO酒石酸Trataric acid为了避免这些酸类的干扰，采用两步滴定法中国药科大学药物分析教研室Ch.P.阿司匹林片阿司匹林片 取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于阿司匹林0.3g)，置锥形瓶中，加中性乙
13、醇(对酚酞指示剂显中性)20ml，振摇使ASA溶解，加酚酞指示液3滴，滴加NaOH液(0.1mol/L)至显粉红色，再精密加NaOH液(0.1mol/L)40ml，置水浴上加热15min，并时时振摇，迅速放冷至室温，用H2SO4液(0.05mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正每每1ml的的NaOH液液(0.1mol/L)相当于相当于18.02mg的的C9H8O4中国药科大学药物分析教研室第一步第一步：NaOH滴定所有的酸：ASA，CA，TA，SA，HAc第二步第二步COONaOCOCH3NaOHCOONaOHNaAc H2O放冷后，用H2SO4滴定液滴定剩余的NaOH V；空白滴定消
14、耗H2SO4 V0；(V0-V)H2SO4则为用于中和水解ASA所需的 NaOHmg02.1810002.1801.01000ASA MT2NaOH H2SO4 Na2SO4 2H2O中国药科大学药物分析教研室计算计算：称取10片重 1.8240gCNaOH 0.1032mol/L片粉重 0.5312gC 0.05120mol/L H2SO4标示量 0.1g V 3.02ml V0 20.18ml%100)(%ASA0 标示量为标示量称样片重WMWMV-VT%7.108%1001.05312.005.01824.005120.0)02.318.20(01802.0-中国药科大学药物分析教研室
15、直接直接水解后水解后 两步两步 滴定法滴定法 剩余滴定法剩余滴定法 滴定法滴定法 优点优点 操作简便 水杨酸干扰少 结果准确，避免了游离 SA以及片剂 中稳定剂的 干扰缺点 游离水杨酸 不能完全 不合格时结 排除干扰 果偏高Ch.P 氯贝丁酯的Assay采用两步滴定法中国药科大学药物分析教研室 Titrimetry in two phases Ch.P 2005用于苯甲酸钠的测定 为芳酸碱金属盐，；苯甲酸不溶于水，不利于终点的正确判断 因此，利用的性质，采用双相滴定法中国药科大学药物分析教研室HCl乙醚(苯甲酸)H2O(苯甲酸钠)0.5mol/L25ml1.5g50ml2d甲基橙甲基橙 橙红色
16、橙红色分出分出H2O层，置具塞层，置具塞锥形瓶锥形瓶，乙醚层用乙醚层用H2O 5ml洗洗涤，洗液并入锥形涤，洗液并入锥形瓶瓶，加乙醚加乙醚20ml，继续继续用用HCl滴定，至水层滴定，至水层显持续的橙红色显持续的橙红色中国药科大学药物分析教研室Column Partition Chromatogr.ASA capsule 等制剂等制剂除用上述两步滴定法外，最好用色谱法最好用色谱法，可以和以及等，经分离后同时测定ASA与SA 如USP用柱分配色谱用柱分配色谱-UV测定测定ASA Capsule中国药科大学药物分析教研室Column Partition Chromatography,CPC担 体：
17、硅藻土(Celite 545)固定相：一定pH的缓冲水溶液流动相：与水不相混溶的有机溶剂 (洗脱前必须先用水饱和)200300mm60mm4mm22mm层析柱玻棉压榨棒350mm21mm中国药科大学药物分析教研室CPC-UV法测定法测定ASA Capsule SA测定测定供试液制备供试液制备用用CHCl3 50ml洗涤，弃去洗涤，弃去(洗去洗去ASA)10ml冰冰HAc-水饱和乙醚液水饱和乙醚液(110)(使使紫色紫色配位化合物被分解配位化合物被分解，SA析出析出)洗脱液收集于已盛有洗脱液收集于已盛有10ml甲醇和甲醇和2滴滴HCl的的50ml量瓶中量瓶中，继用，继用30mlCHCl3洗，并稀
18、释洗，并稀释至刻度至刻度SA对照品溶液对照品溶液：75g/ml，取取10ml 50ml量瓶中盛有：量瓶中盛有：10ml甲醇，甲醇，2滴滴HCl和和10ml冰冰HAc-水饱和水饱和乙醚液乙醚液(110)，CHCl3至至刻度刻度中国药科大学药物分析教研室测定：测定：306nm测定供试液和测定供试液和SA对照品液对照品液SA与试剂生成与试剂生成紫色水杨酸铁紫色水杨酸铁配位化合物，配位化合物，在柱上在柱上移动慢移动慢，带窄带窄，色泽较深，色泽较深若有若有Fe3+洗下，洗下，黄色黄色影响测定结果影响测定结果 消除干扰方法消除干扰方法：迂底部拌有磷酸的硅藻土，：迂底部拌有磷酸的硅藻土，生成不溶解的生成不溶
19、解的FePO4A供试液供试液 A对照品液对照品液L=75(g/ml)10m 100mg1000 100%0.75%中国药科大学药物分析教研室ASA+SA测定测定供试液制备供试液制备洗脱洗脱 5,25mlCHCl3，弃去弃去CHCl3洗脱洗脱 10ml冰冰HAc-CHCl3(110)*；85ml冰冰HAc-CHCl3(1100)，并稀释并稀释至至100ml对照品溶液对照品溶液50g/ml 冰冰HAc-CHCl3(1100)CPC-UV法测定法测定ASA Capsule 中国药科大学药物分析教研室测定测定：280nm 空白空白：CHCl3 NaHCO3使使ASA和和SA成盐成盐保留于柱上保留于柱上
20、 用用CHCl3洗脱的目的洗脱的目的：去除中性或碱性杂质去除中性或碱性杂质冰冰HAc酸化的目的酸化的目的：使使ASA游离游离，易被，易被 CHCl3洗脱洗脱中国药科大学药物分析教研室含量测定含量测定计算公式计算公式所取所取胶囊细粉中胶囊细粉中ASA(mg)(susAAC 供试品溶液吸收度对照品溶液吸收度100550(mg)WCususAAC 1000中国药科大学药物分析教研室利用固定相酸碱性的不同酸碱性的不同进行分离利用药物和固定相起化学反应而进行分离利用生成离子对离子对进行层析分离单纯靠选择流动相进行分离中国药科大学药物分析教研室阿司匹林栓 Aspirin suppositories测定法
21、咖啡因咖啡因乙醇溶液4mg/ml对照品溶液：ASA对照品(约0.15g)50.0ml 内标5.0ml供试品溶液：取本品5粒，精密称定()，4050微温熔融，不断搅拌下冷却至室温，精密称取适量精密称取适量(ASA约约0.15g)(W)W内标5.0ml50.0ml乙醇50.0ml2.0ml2.0ml乙醇50.0ml HPLC中国药科大学药物分析教研室血清中血清中ASA&SA的测定的测定 色谱条件色谱条件 C18 5m 1504.6mm 甲醇甲醇-水水-正丁醇正丁醇(30:20:1)经经0.5 m 滤膜减压过滤后滤膜减压过滤后5 l H3PO4 超声脱气超声脱气 237nm 内标内标：苯甲酸：苯甲酸
22、血清样品的处理血清样品的处理血清样品血清样品100 l 加入加入HClO4(30%)50 l、不同浓度不同浓度ASA&SA对照品稀释液、内对照品稀释液、内标标(各浓度均为各浓度均为10 g/ml混合混合2min离心离心进样进样中国药科大学药物分析教研室血清ASA，SA和内标物对照品色谱图10320.溶剂峰1.ASA2.内标物3.SA中国药科大学药物分析教研室样品预处理方法样品预处理方法样品样品方法方法血清中阿司匹林血清中阿司匹林HClO4沉淀蛋白沉淀蛋白血浆中布洛芬血浆中布洛芬甲醇沉淀蛋白甲醇沉淀蛋白尿中丙磺舒尿中丙磺舒C8固相萃取柱固相萃取柱中国药科大学药物分析教研室药物及其代谢产物药物及其
23、代谢产物从血浆或尿中分离的实验步骤药物从蛋白结合或缀合物中释出蛋白变性蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等)使蛋白沉淀盐酸水解盐酸水解酶消化法酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.011.0使肽键降解)中国药科大学药物分析教研室FPDNPD ECDFIDGLCMS UVHPLC UV CCUV .Chromatogr Column、：衍生化后进行电化学检测、荧光、：、荧光比色、洗脱液：普通、荧光洗脱液：比色、洗脱原位测定或测定)CC(PC)TLC(、型树脂、活性炭、凝胶换树脂、氧化铝、固相提取柱法：离子交剂溶剂提取加盐或其他试净化ODS2XAD-
