1、抗癌药物敏感实验抗癌药物敏感实验一一.实验药物储备液的配制实验药物储备液的配制v一般按试验最高浓度的一般按试验最高浓度的100倍配制储备液。倍配制储备液。v体外药物敏感性试验所用药物浓度，一体外药物敏感性试验所用药物浓度，一般根据血浆高峰浓度的般根据血浆高峰浓度的0.10，1，10倍的剂倍的剂量进行。亦可参考以下公式：量进行。亦可参考以下公式：试验药物浓度（试验药物浓度（ug/ml）v试验时，一般试验时，一般3-5个对数级浓度个对数级浓度 平均体重平均体重 60 mg平均体表面积平均体表面积 100二二.受试细胞的准备受试细胞的准备 根据实验目的选用体外培养的肿瘤根据实验目的选用体外培养的肿瘤
2、细胞系如国际通用的细胞系如国际通用的HelaHela细胞系等，细胞系等，也可用肿瘤患者的新鲜手术标本制成也可用肿瘤患者的新鲜手术标本制成细胞悬液备用。细胞悬液备用。三三.药物疗效的评价药物疗效的评价1.1.体外抑瘤试验：体外抑瘤试验：合成化合物或植物合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度提取物纯品的半数抑制浓度ICIC505010ug/ml10ug/ml或植物粗提物的或植物粗提物的ICIC505020ug/ml20ug/ml，并且有细胞毒性的剂量依并且有细胞毒性的剂量依赖关系，其最高抑制效应达赖关系，其最高抑制效应达8080以上；以上；发酵液发酵液ICIC5050大于大于1 1：100100
3、，则判定样品，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。在体外对细胞有杀伤作用。2.2.体内抑瘤试验：体内抑瘤试验：v实体瘤实体瘤疗效以瘤重抑制百分率表示，即疗效以瘤重抑制百分率表示，即瘤重抑制率（瘤重抑制率（1-1-试验组瘤重试验组瘤重/对照组瘤重）对照组瘤重）100100 中草药抑制率中草药抑制率3030，合成药，合成药4040v腹水型肿瘤腹水型肿瘤疗效可以生命延长率表示，疗效可以生命延长率表示，即即生命延长率（试验组存活天数生命延长率（试验组存活天数/对照组存活天数对照组存活天数-1-1）100100非腹腔给药生命延长率非腹腔给药生命延长率5050，腹腔给药，腹腔给药生命延长率生命延长率7575
4、四四.药物敏感性实验药物敏感性实验1.1.体外药物敏感试验体外药物敏感试验 美蓝法：美蓝法：利用活细胞的脱氢酶利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，是美蓝还原为甲烯白提供氢离子，是美蓝还原为甲烯白（无色）。细胞死亡后脱氢酶失活（无色）。细胞死亡后脱氢酶失活无法使美蓝还原，故染成蓝色。检无法使美蓝还原，故染成蓝色。检验用药后死细胞数反映药物抑瘤作验用药后死细胞数反映药物抑瘤作用。假阳性率较高。用。假阳性率较高。2.2.染料排斥实验法：染料排斥实验法：根据活细胞在低浓度染液不着根据活细胞在低浓度染液不着色特点，一般用色特点，一般用0.20.2台盼蓝或台盼蓝或0.10.1伊红试验。药物导致细胞死亡时，伊红试
5、验。药物导致细胞死亡时，细胞膜通透性增加，染料易透过细细胞膜通透性增加，染料易透过细胞膜。加药后计算阳性细胞数以示胞膜。加药后计算阳性细胞数以示药效。由于濒临死亡的细胞不易着药效。由于濒临死亡的细胞不易着色，故假阴性较高。色，故假阴性较高。3.3.生长曲线测定法生长曲线测定法1 1）药物对细胞的杀伤率药物对细胞的杀伤率 将对照组及加药组生长曲线的线性部将对照组及加药组生长曲线的线性部分延伸至分延伸至Y Y轴，可分别得到截距轴，可分别得到截距N NO O及及N NO O。代表接种后具有增殖力的细胞数。代表接种后具有增殖力的细胞数。药物对增殖细胞的杀伤率药物对增殖细胞的杀伤率 （N NO O N
6、NO O）/NO/NO1001002 2）药物对倍增时间（）药物对倍增时间（T TD D)的影响的影响 T TD=D=t t 2 2 NtNt N N0 0 t t代表培养时间，代表培养时间，N N0 0 和和NtNt分别代分别代表接种后及培养表接种后及培养1 1小时后的细胞数。小时后的细胞数。如倍增时间延长则表明药物使细胞增如倍增时间延长则表明药物使细胞增殖能力减弱。殖能力减弱。3 3）药物对细胞生长饱和密度（）药物对细胞生长饱和密度（NsNs）的影响的影响 取出在生长稳定期的培养细胞，计数单取出在生长稳定期的培养细胞，计数单位面积或体积的细胞均数，即细胞生长饱和位面积或体积的细胞均数，即细
7、胞生长饱和密度。该值减小也表示细胞增殖活性减弱。密度。该值减小也表示细胞增殖活性减弱。4 4）放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法）放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法 常用常用3 3H-TDRH-TDR或或3 3H-UDRH-UDR掺入掺入DNADNA或或RNARNA合成合成期的细胞，用液体闪烁计数仪测知标记的期的细胞，用液体闪烁计数仪测知标记的DNADNA或或RNARNA的含量，从而了解药物对肿瘤细胞的含量，从而了解药物对肿瘤细胞DNADNA或或RNARNA合成的抑制效应。合成的抑制效应。5 5）四唑盐（）四唑盐（MTTMTT）比色法比色法 Mosmann Mosmann（19831983）首
8、先报道此法。简便首先报道此法。简便快速，便于大规模进行药敏试验，误差小快速，便于大规模进行药敏试验，误差小且精确，无放射性污染。广泛应用于临床。且精确，无放射性污染。广泛应用于临床。接种细胞接种细胞 培养细胞培养细胞 3-5 3-5天后每孔天后每孔加入加入MTTMTT溶液（溶液（5 5mg/mlmg/ml）20ul20ul，孵育孵育4 4h h终止终止培养吸弃上清培养吸弃上清 每孔加每孔加150150ulDMSOulDMSO振荡振荡1010min min 比色：选择比色：选择490490nmnm波长酶联免疫波长酶联免疫检测仪测定光吸收值并绘制吸收曲线检测仪测定光吸收值并绘制吸收曲线6 6）三磷
9、酸腺苷生物发光法（三磷酸腺苷生物发光法（ATPATPbioluminesence bioluminesence assayassay）是一种敏感可靠能测定各种细胞活是一种敏感可靠能测定各种细胞活力的方法。力的方法。7 7）集落形成试验法集落形成试验法8 8）3 3H H亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法9 9）抗癌药物的效能比测定法抗癌药物的效能比测定法2.2.体内抗癌药物敏感试验体内抗癌药物敏感试验1 1）裸鼠移植瘤试验）裸鼠移植瘤试验 1973 1973年丹麦的年丹麦的C.W.C.W.FriisFriis在在BALB/BALB/cAcA近交系小鼠中发现自发性突变的无毛近交
10、系小鼠中发现自发性突变的无毛小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免疫疫T T细胞缺失，而培育成了细胞缺失，而培育成了BALB/BALB/cAcA-nunu。之后引至日本实验动物中央研究所，之后引至日本实验动物中央研究所，19891989年自日本实验动物中央研究所引年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。入到中科院上海实验动物中心。裸鼠特点裸鼠特点:v先天性胸腺缺损先天性胸腺缺损v胸腺依赖性免疫功能缺乏，胸腺依赖性免疫功能缺乏，T细胞功能细胞功能接近于零，但接近于零，但B细胞功能基本正常细胞功能基本正常v异种移植时无排斥反应异种移植时无排斥反应 故可以进
11、行人体故可以进行人体 肿瘤异种移植。肿瘤异种移植。2 2）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验 1978 1978年年BogdenBogden首先报道了将人肿瘤组织首先报道了将人肿瘤组织移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。细胞的克隆化技术细胞的克隆化技术 细胞克隆（细胞克隆（cell cloning）：）：又又称单细胞克隆，即把单个细胞从群体称单细胞克隆，即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。成一个新的细胞群体的培养技术。原代培养细胞和有限细胞洗（二原代培养细胞和有限
12、细胞洗（二倍体细胞）比较困难，无限细胞系，倍体细胞）比较困难，无限细胞系，转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。一一.克隆培养（克隆培养（clone cultureclone culture）技术技术1.1.稀释铺板法稀释铺板法 消化法制备低密度细胞悬液（消化法制备低密度细胞悬液（1 12 2个个/mlml）0.5ml/0.5ml/孔接种于培养板孔接种于培养板 6 61212h h后观察标记含单个细胞的孔后观察标记含单个细胞的孔 待孔内细胞增至待孔内细胞增至500-600500-600个时进行分离个时进行分离培养培养 分离扩大培养分离扩大培养2.2.饲养层克隆法饲养层克隆
13、法v 饲养细胞（饲养细胞（feeder cellfeeder cell）：为了使刚刚克隆化的极少量细胞生为了使刚刚克隆化的极少量细胞生长繁殖，在培养皿中加入能贴壁生长繁殖，在培养皿中加入能贴壁生长的其它细胞。长的其它细胞。v 常用细胞：常用细胞：成纤维细胞，胸腺成纤维细胞，胸腺细胞，巨噬细胞。细胞，巨噬细胞。v 饲养细胞制备繁琐，应用较少。饲养细胞制备繁琐，应用较少。3.3.胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法 用胶原膜层或血纤维膜层取代饲养用胶原膜层或血纤维膜层取代饲养细胞，帮助单个细胞和密度极低的分散细胞，帮助单个细胞和密度极低的分散细胞黏附和贴壁，存活并繁殖。
14、细胞黏附和贴壁，存活并繁殖。4.4.琼脂克隆法琼脂克隆法 琼脂是生长基质层帮助细胞贴附生琼脂是生长基质层帮助细胞贴附生长。适于病毒转化细胞和恶性转化细胞。长。适于病毒转化细胞和恶性转化细胞。5.5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化二二.影响克隆形成率的因素影响克隆形成率的因素 接种众多单个分散细胞，经培养后能接种众多单个分散细胞，经培养后能够增生形成克隆的百分数称够增生形成克隆的百分数称克隆率或接种克隆率或接种率（率（cloning efficiencycloning efficiency）。影响因素：影响因素：接种细胞密度：接种细胞密度：细胞悬液的细胞密度越细胞悬
15、液的细胞密度越大大,克隆形成率越低克隆形成率越低培养基：培养基：Ham F12KHam F12K培养液是最好的克隆化培养液是最好的克隆化培养液。培养液。血清：血清：胎牛血清好于小牛血清。胎牛血清好于小牛血清。饲养细胞：饲养细胞：有利于克隆的形成。有利于克隆的形成。激素和生长因子：激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，胰岛素，地塞米松，表皮生长因子等可以促进不同细胞生长。表皮生长因子等可以促进不同细胞生长。CO2:对绝大多数细胞克隆形成率有提对绝大多数细胞克隆形成率有提高作用，常用高作用，常用5浓度。浓度。适应性生长基质：适应性生长基质：不同细胞采用不同生不同细胞采用不同生长基质。长基质。三三.克隆的分离克隆的分离1.1.克隆化环分离法克隆化环分离法2.2.射线照射分离法射线照射分离法3.3.半固体培养基悬浮培养细胞克半固体培养基悬浮培养细胞克隆分离法隆分离法
