1、1细胞内DNA复制的条件原料 4种 模板2条DNA母链酶 和 引物使DNA聚合酶能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶3端 2PCR扩增的原理及条件 (1)PCR技术：即 ，是一种 迅速扩增 的技术。它能以极少量的 为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)扩增方向：总是从子链的 端向 端延伸。多聚酶链式反应体外DNA片段DNA53 (3)引物：特点：是一小段 或 ，能与 的一段碱基序列互补配对，用于PCR的引物长度通常为 个核苷酸。需要引物的原因：DNA聚合酶不能 ，而只能从 延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。DNARNADNA母链2030从头合成DNA3
2、端3PCR的反应过程(1)：温度上升到90 以上时，双链DNA解旋为 单链(2)：温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补 配对与两条单链DNA结合(3)：温度上升到72 左右时，在 酶的作 用下，四种脱氧核苷酸通过碱基互补配对合 成新DNA链变性复性延伸DNA聚合1DNA复制时为什么需要引物？提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。2PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。3利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？提示：1/2n；100%。思考探究1细胞内D
3、NA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋解旋酶，边解旋边复制80 100 高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温子链合成一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连结(滞后链)两条子链均连续合成相同点提供DNA模板四种脱氧核苷酸作原料子链延伸的方向都是从5端到3端2PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链，如图：(2)复性：系统温度下降至50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：(3)延伸：当系
4、统温度上升至72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：PCR反应的结果：PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。特别提醒 例1 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下变性(使模板DNA解旋)55下复性(引物与DNA模板链结合)72下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与D
5、NA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高解析变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。答案C例2 在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图
6、回答相关问题：a链 5GGTC35GGOH(引物)b链3CCAG5 (引物)95 5GGTC33CCAG555 5GGTC33CCAG572 5GGOH _ _(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是_；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。解析(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，引物就提供了3端。子链延伸方向为53，引物与b链部分碱基互补，引物则与a链部分碱基互补，且连
7、接到a链的3端，故引物的结构为5GAOH，复性结果为：HOAG5 5GGTC3。(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物和引物。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n2)1/2n。答案(1)5GAOHa链5GGTC3 HOAG5(2)5GGTC33CCAG5 3CCAG55GGTC3(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记1/2n微量移液器1实验操作程序 准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放 于实验桌上
8、 移液：用 按照配方在微量离心管中依 次加入各组分 混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 ：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在 反应：将离心管放入 中，设置程序进行反应。离心管底部PCR仪离心2DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在 的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。(2)计算公式：DNA含量(g/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。260nm1实验操作注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后
9、，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。2结果分析与评价 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测量，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下：(1)稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为：DNA含量(g/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。(3)测定：取DNA稀释液100L至比色杯，需测定260nm处的光吸收值。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。公式中的50代表在波长260nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50g/mL。特别提醒 理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一个DNA分子作模板，则复制n次后有2n个DNA分子；若一开始有m个DNA分子作模板，则复制n次后有m2n个DNA分子；实际操作过程中由于无关变量的影响，一般来说实际值要略小于理论值。归纳拓展DNA扩增数目的理论计算退出
