1、现代药学生物技术综合大实验基因克隆基因克隆基因表达基因表达重组蛋白重组蛋白纯化纯化鉴定鉴定基因克隆与重组子构建基因克隆与重组子构建基因表达与重组蛋白纯化基因表达与重组蛋白纯化多克隆抗体制备与鉴定多克隆抗体制备与鉴定第一部分基因克隆与重组子构建参照药学分子生物学第八章基因克隆与重组子构建路线图pET-28aEGFPpEGFPpEGFP菌株菌株培养培养提取质粒提取质粒经酶切获得经酶切获得EGFPpET-28a菌菌株株培养培养提取质粒提取质粒双酶切双酶切pET-28aEGFP提取质粒、鉴提取质粒、鉴定定扩大培养扩大培养PCR鉴定鉴定连接、转化连接、转化DH5a a2022-11-104中山大学药学院
2、 王红胜高压灭菌法灭菌 概念 灭菌系指培养基、发酵设备或其他目标物中所有微生物的营养细胞及其芽胞（或孢子）杀灭或去除，从而达到无菌的过程；消毒 是指杀灭病原微生物和其他有害微生物，并不要求清除或杀灭所有微生物（如芽胞等）；灭菌法 是指预先用物理方法，彻底消灭掉接触物品上所附带的微生物；消毒法 常指应用化学方法来消灭微生物。2022-11-106中山大学药学院 王红胜灭菌法 灭菌法所用的物理方法：器械和应用物品可用高温来灭菌。电离辐射主要用于药物如抗生素、激素、类固醇、维生素等，以及塑料注射器和缝线等的灭菌。紫外线可以杀灭悬浮在空气中、水中和附于物体表面的细菌、真菌、支原体和病毒等。但它不能射入
3、食物和衣料、被服等纺织物，故一般常用于室内空气的灭菌。2022-11-107中山大学药学院 王红胜高压蒸汽灭菌法的注意事项 无菌包不宜过大，不宜过紧；液体要保证有透气孔存在；布类物品应放在金属类物品上；高压蒸汽灭菌效果的监测：第一种是工艺监测：根据安装在灭菌器上的量器（压力表、温度表、计时表）指示灭菌设备工作正常与否。第二种是化学指示监测，3M压力灭菌指示胶带：此胶带上印有斜形白色指示线条图案。在121经20分钟，130经4分钟后，胶带变色（条纹图案即显现黑色斜条）。2022-11-108中山大学药学院 王红胜基因工程菌 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”
4、。工程菌是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点 如：大 多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。Dam甲基化酶可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基 Dcm甲基化酶在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基2022-11-1010中山大学药学院 王红胜DH5 是世界上最常用的生物工程菌株之一，特别是在克隆的应用，其主要特征为：endA1突变：使endA(限制性内切酶)无 酶活性，有利于质粒的稳定。(lacZ)M15突变：其表达产物与pUC载体编码的-半乳糖苷酶氨基端实现互补，可
5、用于蓝白斑筛选。recA 突变：限制DNA重组，使导入的DNA稳定。2022-11-1011中山大学药学院 王红胜互补 lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做互补（-complementation）。白色克隆为阳性重组克隆，蓝色的为载体自连的克隆2022-11-10中山大学药学院 王红胜12BL21(DE3)菌株 适合于重组蛋白表达的常用菌株 基因组中整合有l噬菌体
6、T7噬菌体RNA聚合酶基因位于噬菌体DE3区，表达受控于lacUV5启动子的 用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。2022-11-1013中山大学药学院 王红胜基因工程用载体 载体(vector,vehicle)的本意就是媒介体，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子。基因工程中有三种主要类型的载体质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒。2022-11-1015中山大学药学院 王红胜载体必须具备的几个性能1.分子较小，可携带比较大的DNA片段。2.能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3.要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的
7、切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。4.有适合的标记，易于选择。5.有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。6.从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。2022-11-1016中山大学药学院 王红胜载体的分类 根据功能 克隆载体:克隆一个基因或DNA片断 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体组中2022-11-1017中山大学药学院 王红胜 根据来源：质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞表达载体 其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯
8、质粒是质粒和噬菌体DNA的结合体，运载能力最高。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。2022-11-1018中山大学药学院 王红胜质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因。2022-11-1019中山大学药学院 王红胜质粒载体克隆的质粒载体克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要用于DNA水平上的操作基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。含有启动子2022-11-1020中山大学药学院 王红胜作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicato
9、r，Ori）选择性记号（Amp,Kana)克隆位点(MCS)2022-11-1021中山大学药学院 王红胜大肠杆菌表达质粒pET-28a 是原核基因表达质粒 具有卡那霉素抗性基因 LacI基因序列 LacZ序列 T7聚合酶启动子 His6标签2022-11-1023中山大学药学院 王红胜2022-11-1024中山大学药学院 王红胜真核表达质粒pEGFP/N32022-11-1026中山大学药学院 王红胜实验内容上午上午1.高压灭菌1000、200 ul枪头各1盒，1.5、0.5mlEP管各一盒，玻璃试管10个（分两包）用报纸或布包好高压灭菌；2.配制缓冲液配制50TAE 1000ml（1组），各组配制LB液体培养基200ml0.1M Tris-HCl（pH8.5）100ml（2组）。各组取其1ml+9ml水（10mM Tris-HCl）SOC培养液100ml（3组）Kana(4组）下午下午1.制备LB平板 制备空白LB板2块 kana抗性LB平板4块2.菌种接种培养pEGFP-N3菌种：接种于5ml LB培养液2管pET-28a菌种：接种于5ml LB培养液2管2022-11-1027中山大学药学院 王红胜
