1、免疫细胞的分离密度梯度分离法磁珠分离法fluorescence-activated cell sorter，FACS免疫细胞功能的测定T细胞B细胞巨噬细胞NK细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。PBMC的密度与血液中的其他成分不同:血小板的密度为1.0301.035，粒细胞为1.092，红细胞为1.093，淋巴细胞和单核细胞的密度为1.0751.090。利用一种密度介于1.0751.092之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心
2、，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺Ficoll-Hypaque分层液法和Percoll分层液法两种。聚蔗糖-泛影葡胺分层液法是分离PBMC一种单次密度梯度离心分离法 特异性分离所需淋巴细胞的方法。将特异性抗体(如抗CD3、抗CD4、抗CD8等)吸附在铁颗粒(磁珠)上，加至细胞悬液中，具有相应抗原的细胞与磁珠上的特异性抗体结合。反应管置于磁场中，铁颗粒受磁场的吸引，携带有相应细胞的磁球吸附于靠近磁铁的管壁上。弃细胞悬液，重新解离细胞与磁珠。autoMACS?Pro SeparatorWalk-away cell sorting of multipl
3、e samplesCliniMACS Plus InstrumentThe CliniMACS?Systema closed and sterilesystem for separation of large cell samples使用酶、免疫荧光标记单抗进行鉴定使用酶、免疫荧光标记单抗进行鉴定 Th1 (IFN-r、T-bet）Th2 （IL-4、IL-5、IL-13、GATA-3）CD4+T cell Th17（IL-17A、IL-17F、IL-22、ROR t）Treg （CD4+、CD25+、CD127low、Foxp3）Tfh （CXCR5、ICOS、BcL6）CD8+T cell
4、:CTLT细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养CTL介导的细胞毒试验介导的细胞毒试验 用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。刺激刺激T细胞增殖的因素及意义细胞增殖的因素及意义 1.特异性抗原：引起寡克隆活化增殖。可用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反应 能力，也能反映T细胞总体的功能。2.丝裂原：多克隆。3.刺激信号转导分子：（Anti-CD3、Anti-CD28 mAb）多克隆。T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法（一）体外增殖检测 1.3H胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（TdR）掺入法：）掺入法：T细胞增殖时，伴随细胞内DNA
5、合成，在细胞增殖的高峰期时可通过加入（3HTdR）到培养体系中，处于增殖的T细胞可摄取3HTdR用于合成DNA，细胞增殖程度与细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。2.流式细胞仪计数法：流式细胞仪计数法：T细胞增殖最直接的结果就是细胞数量的明显增加，因此可以采用T细胞表面标志（如：CD4 或 CD8）的荧光抗体联合排除死细胞的试剂 PI 或 7-AAD 标记出存活的特定的 T 细胞群体，然后在流式细胞仪上对标记出的T细胞群体进行准确的计数。T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法（一）体外增殖检测 3.CFSE 分裂法：分裂法
6、：羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）可通透细胞膜进入细胞，原先为无色且不发生荧光，在进入细胞后可被细胞内酯酶催化分解成高荧光强度的物质并与细胞内胺稳定结合从而使细胞标记上高荧光强度的CFSE。细胞分裂时,CFSE能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出8-10代的子细胞。CFSE已被广泛应用于T细胞增殖的体内和体外检测,并可用于追踪T淋巴细胞的体内迁移与组织定位.T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法（一）体外增殖检测 4.MTT 法：法：MTT四唑蓝是一种能接受氢原子的染料，可直接加入到细胞培养基中，被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的深紫色结晶状产物 formazan，但
7、死细胞不能进行此还原反应。用特定溶剂可溶解MTT所产生的水不溶性紫色结晶，然后用酶标仪在570 nm波长附近(500600 nm)处测定光吸收值，可反映活细胞的数量和代谢活力，并由此反映细胞的存活、增殖、生长、和毒性。T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法（二）体内增殖检测BrdU 掺入法：掺入法：Bromodeoxyuridine(BrdU)是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合使用荧光标记的BrdU抗体能够检测到BrdU,反映体内某些特定细胞的增殖状态原原 理理 测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初
8、次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。方法方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）1.分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理2.96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20g/ml。每一种浓度设3复孔4.37C，5CO2，6天5.加3HTdR，继续培养18小时，计数。结果解释
9、：结果解释：1.对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。2.HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。注意事项注意事项:1.培养液中最好用人AB血清。2.此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加510自身APC。应用实践应用实践 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。诱导诱导T细胞增殖反应的丝裂原细胞增殖反应的丝裂原 1.PHA（植物血凝素）2.Con A（刀豆蛋白 A）3.PMN（美洲商陆）方法：方法：1.用RPMI10将PBMC配成1x106/ml的悬液。2.用100g/ml的PHA
10、配制1:10、1:20和1:40稀释液。3.96孔板中选择一行（共12孔），每孔加入100l细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的 PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。4.37C，5CO2，54h。5.配制浓度为100ci/ml的3HTdR。6.每孔加入1ci 3HTdR，继续培养18h。7.用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶 解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR ，最后用100的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。8.将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。9.扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。影响因素影响因素1.细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后
11、应检查细胞活力。2.培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。3.细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。4.微生物污染：可降低细胞增殖能力。应用实践应用实践 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。原原 理理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异
12、型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。双向混合淋巴细胞培养试验。将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应单向混合淋巴细胞培养反应。方法方法 1.分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml 2.刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25g，37 C，5C，30m
13、in）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。3.96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。37C，5CO2，46d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞，设3复孔。4.收集细胞，液闪仪计数，打印结果。5.计算相对反应（RR）（实验组cpm阴性对照组cpm）RR 阳性对照组cpm阴性对照组cpm 注意事项注意事项 1.细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。2.培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。3.本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。应用实践
14、应用实践1）主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度；2）也可用于移植后急性排斥反应的监测指标和HLA、H-2II类抗原的分型等研究；3）在研究淋巴细胞功能和免疫调节中也有广泛应用。基础理论基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。1.细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。2.细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗
15、粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，在细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。51Cr释放法：释放法：在将靶细胞与CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育，51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后，51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。LDH释放法释放法:酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死
16、亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。方法：方法：1.从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。2.51Cr标记肿瘤细胞。3.96孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为50:1，25:1，12.5:1。另设最大释放对照（靶细胞加去污剂）和自发释放对照（不加CTL）。4.37C，5CO2，4h。5.收集上清，计数器测定放射活性（cpm）。计算公式计算公式 试验组平均CPM值自发释放组平均cpm值溶解
17、 最大释放平均cpm值自发释放平均cpm值 注意事项注意事项 由于CTL杀伤靶细胞受MHC限制，所以靶细胞必须来自自身，或选用表达适当MHC的肿瘤细胞系。优点优点：方法简单、快速，能定量。缺点缺点：自然释放率高，需要靶细胞量多。使用放射性核素。应用实践应用实践 这一方法常用于评估肿瘤患者CTL杀伤肿瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指标之一。用生物素化的抗原肽MHC分子复合物与荧光标记的亲合素结合，由于1个荧光素标记的亲合素可结合4个生物素分子，能使4个MHC抗原肽复合物形成一个复合体，将该复合体标记荧光素后，即成抗原特异性四聚体。抗原特异性四聚体能与样品中的特异性T细胞的TCR结合，由于四
18、聚体能同时结合一个T细胞表面的4个TCR，亲和力大大提高。用流式细胞术即可确定待检标本中流式细胞术即可确定待检标本中抗原特异性抗原特异性CTLCTL细胞的频率细胞的频率。MHC分子可为I类或类分子，与抗原肽形成的四聚体复合物，可分别鉴定表达特异性TCR的CD8+T细胞及CD4+T细胞的频率。B淋巴细胞的分离：淋巴细胞的分离：尼龙毛法、磁珠分离法 CD19（B220）/CD45R+B淋巴细胞的活化方法：淋巴细胞的活化方法：Anti-IgM Ab；CD40L、LPS、PWMB淋巴细胞的增殖检测：淋巴细胞的增殖检测：3H-TdR渗入法、BrdU掺入法测定测定B细胞产生抗体的能力细胞产生抗体的能力：E
19、LISA、ELISPOT 基础理论基础理论 B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最重要的方法。B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。基础理论基础理论 ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（enzymelinked immunospot assay），可用于测定产生），可用于测定产生IgG和和IgM抗体的抗体的B细胞。其
20、方法是用抗原包被固相，然后细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性加入抗原特异性B细胞。如果细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。个斑点就代表一个产生抗体的细胞。技术方法技术方法1.抗原包被：37C2h，或4C过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。2.抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，37C，5CO2，过夜。洗涤，去除未与固相结合的细胞3.测定斑点产生细胞：加二抗，37C，5CO2，23h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底
21、物显色。4.计数：24h后用1030倍显微镜下计数斑点形成细胞评价评价1.在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。2.硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。3.与ELISA联合使用，可以估计单个细胞的抗体产量。4.当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，所以适用于测定组织中抗体生成细胞。应用实践应用实践 用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。基础理论基础理论 B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗，结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类别。方法方法1.包板：9
22、6孔板用浓度为10g/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C，5CO2，2h，或4C过夜。常规洗板，封闭。2.上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液100l。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C过夜。3.加酶标二抗：每孔加100l碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C过夜。4.显色：洗板，每孔加100l底物（pnitrophenyl phosphate）。5.自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。评价评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二
23、抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。应用实践应用实践 ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。巨噬细胞的分离：巨噬细胞的分离：人外周血单个核细胞(PBMC)的分离 （Ficoll/Percoll 密度梯度法、磁珠分离法）小鼠腹腔巨噬细胞的分离和纯化 小鼠骨髓巨噬细胞的分离和诱导培养 （GM-CSF、M-CSF、IL-3）u巨噬细胞的表型鉴定：巨噬细胞的表型鉴定：流式细胞仪（直接法/间接法），常用 Marker:CD14、CD11b、CD16、CD32、CD64、CD68、F4/80、HLA-DR
24、et al.u巨噬细胞的活化：巨噬细胞的活化：IFN-r（2U/ml)）、LPS（10ng/ml）u巨噬细胞的功能检测：巨噬细胞的功能检测：巨噬细胞吞噬鸡红细胞/FITC标记细菌 巨噬细胞杀伤功能测定（吞噬杀灭细菌、Fc受体介导的吞噬作用 等）巨噬细胞抗肿瘤活性测定（H33342 释放 法/51Cr释放法检测 M对靶细胞的杀伤）NK细胞的分离：细胞的分离：PBMC 的分离：Percoll 密度梯度法 磁珠 分离法（Positive selection:CD16+、CD56+；Negative selection:CD3+、CD19+、CD14+and CD5+）uNK细胞的表型鉴定：细胞的表型鉴定：流式细胞仪（直接法/间接法），常用 Marker:Human：CD56+、CD16+、CD3、TCR/BCR;Mouse:NK1.1、CD49b+(DX5+)、CD3、TCR/BCR;uNK细胞的活化：细胞的活化：IL-2、IL-12、IL-18 and IFN-r et.al.uNK细胞的功能检测：细胞的功能检测：NK细胞杀伤功能测定（Fc受体介导的 ADCC作用）NK细胞抗肿瘤活性测定（LDH 释放 法/51Cr释放法检测 NK对靶细胞的杀伤）
