1、重组DNA技术与基因工程523416重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立
2、合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。4 目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性A 鸟枪法4 目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目
3、的基因断开，大小不可控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。鸟枪法克隆目的基因的基本战略如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；转化受体细胞 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果
4、已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 而提高重组子中目的重组子的出现频率。例如：已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb行拼接。鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法破碎法凝胶DNA片段回收技术 鸟枪法操作的改进滤纸法破碎法鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要
5、了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构B cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性4 目的基因的克隆与基因文库的构建cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNAcDNA第一链的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPscDNA法克隆目的基因的基本战略 cD
6、NA第二链的合成 煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA 5 端会有几对碱基缺失。AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1DNApol dNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA 5 端也会有几对碱基缺失。5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 55S1 AAAA
7、AAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTT 55AAAAAAAAAAAAAA 33T4-DNA ligasecDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成 dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5 端序列。5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAAOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGG
8、GGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成 cDNA法克隆目的基因的基本战略双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段。加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收，如RT-PCR。cDNA法克隆目的基因的基本战略RT-PCR法克隆双链cDNA 自上世纪九十年代PCR技术的普及以来，人们通常将mRNA的反转录与PCR技术相偶联，即在cDNA第一链合成
9、之后，直接投入相应的引物和PCR专用的DNA聚合酶，以高效特异性合成双链cDNA分子，此项技术称为RT-PCR。cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。特异分离程序较适用于mRNA丰度极高
10、的目的基因克隆如血红蛋白基因等。cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因
11、的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因 C PCR法PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR克隆目的基因的基本程序PCR技术的诞生与发展4 目的基因的克隆与基因文库的构建PCR技术的诞生与发展 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；1988年，美国PE-cetu
12、s公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物。PCR法定向扩增目的基因的基本原理55目的基因5变性加热55引物退火55底物聚合5555加热变性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而
13、且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的PCR克隆目的基因的基本程序 基于T载体的切接克隆法55AATT55PCR扩增产物T 载体T7lacZ MCSoriAprT载体克隆。PCR克隆目的基因的基本程序基于同源重组的In-Fusion克隆法555555与载体5端15个碱基相同的序列目的基因序列PCR扩增In-Fusion酶介导同源重组盒式PCR扩增法 适用于外侧序列未知的靶基因扩增染色体DNASau3A部分酶切连接，加装盒式接头片段5 端不含磷酸基团变性 引物退火P1P2
14、P1退火延伸5 5 5 基因内引物扩增5 5 5 P25 5 5 P1、P2为盒式引物5 5 测序设计保守引物基因组DNA切割并自连成环反向PCR扩增法TAGTSLVVRKNYWSSAEPHC蛋白质55555555根据已知的氨基酸序列设计简并引物简并引物介导RT-PCR保守引物介导PCR测序确定目标基因的两端序列D 化学合成法化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途4 目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本战略 全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。
15、T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 补钉延长法：混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段。T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合化学合成法的基本战略 全基因合成大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合化学合成法的基本战略 全基因合成或RCR扩增 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相
16、对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。化学合成法的基本战略 全基因合成化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子。由于大多数氨基酸拥有简并密码子故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现
17、可能的互补区域化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列：Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile所有可能的DNA序列：TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC设计的简并探针序列：TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGA A G此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计。expressed sequence tag化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照
18、序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩 从反应机理上来讲，DNA化学合成方式有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序较简合、分离、去保护五大操作单元。便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造
19、基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。基因等。E 基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序4 目的基因的克隆与基因文库的构建基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）。基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基
20、因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA。用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA。在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的平均大
21、小/生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的基本概念基因文库的构建程序 基因组DNA的制备
22、为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段。基因文库的构建程序基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大
23、小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！基因文库的构建程序 载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。l-DNA 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒15
24、 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC1000 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆基因文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！为了
25、避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作。基因组文库重组克隆的排序 将单一的YAC克隆插
26、入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解酶切片段末端标记法 然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的成若干片段，末端标记同位素。电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC特征性DNA指纹图谱。克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的。基因组文库重组克隆的排序 酶切片段末端标记法HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体DNA克隆DNA基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一
27、个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列染色体走读法（chromosome walking）分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0 kb范围内。然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。线型染色体DNA的端点。基因组文库重组克隆的排序 染色体走读法走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交走读的起点克隆片段基因组文库重组克隆的排序 染色体走读法4 目的基因的克隆与基因文库的构建C PCR法B cDNA法A 鸟枪法D 化学合成法E 基因文库的构建
