1、层析工艺设计和优化李李 岩岩 email:中国科学院过程工程研究所中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室生化工程国家重点实验室第一部分基础理论分离纯化的一般流程分离纯化的一般流程细胞破碎澄清分离破碎细胞概述破碎细胞概述珠磨压榨固体剪切高压匀浆超声液体剪切机械法冻溶法酶溶化学去垢剂溶胞作用非机械法细胞破碎方法压撞 剪切 渗透 冻胀 破壁破膜超声破碎超声破碎(Ultrasonication)l作用机理：声频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理一般认为与空化现象(Cavitation)引起的冲击波和剪切力有关。l空化现象是在强声波作用下，气泡形成、长大和破
2、碎的现象。l超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。反复冻融法反复冻融法l细胞含有大量水份，快速冷冻时，胞内水结晶形成大量晶核，体积增大将细胞胀破达到破碎细胞的目的；此外，冷冻过程促使细胞膜疏水键断裂增加了细胞的亲水性。l 一般将40-70%的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻，冻结后，取出在室温下融化，然后再冷冻，反复进行，通常需三次以上，酶的释放率才可能达到满意。l冻融法十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。高压匀浆法高压匀浆法高压匀浆器：由高压泵和匀浆器组成易于实现工业放大珠磨破碎法珠磨破碎法利用珠磨机内大量的研磨剂(玻璃
3、珠、钢珠或陶瓷珠)在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的目的。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留珠体，从而实现连续操作。指标指标高压匀浆法高压匀浆法高速珠磨法高速珠磨法操作参数操作参数少，易于确定少，易于确定多，凭经验估计多，凭经验估计操作次数操作次数24次次1次次冷却冷却用换热器级间冷却用换热器级间冷却采用夹套冷却，减少采用夹套冷却，减少产品失活可能产品失活可能应用范围应用范围丝状真菌和小革兰氏阳性丝状真菌和小革兰氏阳性菌菌,及含包涵体细胞除外及含包涵体细胞除外几乎所有微生物几乎所有微生物制备放大制备放大易易较难较难高压匀浆法同高速珠磨法的比较高压匀浆
4、法同高速珠磨法的比较不论高压匀浆法和高速珠磨法，都不仅以破碎率为基准，而需考虑产物的收率和兼顾上下游过程澄清技术概述澄清技术概述离心：适用于实验室过滤：板框过滤适用于生产微滤：采用不同的组件适用于实验室和生产规模分离方法概述分离方法概述沉淀法：经典的方法（血液制品生产中仍在沿用）超速离心：分离病毒的经典方法超滤：主要用于浓缩和缓冲液置换层析：目前GMP发展的趋势沉淀法沉淀法盐沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀酸沉淀非离子多聚物沉淀聚电解质沉淀l水化层的破坏l静电排斥力的降低l疏水性的增加l大分子的介导脱水过程示意图冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白各步所沉淀下来的蛋白各步所沉淀下来的蛋白
5、超离心技术超离心技术n发展历史Svedberg，winner of the 1926 Nobel Prize in chemistry for his work on colloids and his invention of the ultracentrifugen优良的学术传承Tiselius1948年诺贝尔化学奖Bjorn Ingelman发现了葡聚糖Porath and Flodin于1959年在Nature上发表了有关凝胶过滤层析的第一篇论文书籍推荐书籍推荐金绿松，林元喜主编离心分离，化学工业出版社出版，2008年单元操作超速离心因子Fr：离心力/重力的比值离心分离Fr=1.1191
6、0-5n2 rn:转速，转/分钟；r:转鼓半径，cm衡量离心设备的离心程度的重要技术参数按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr 1.91.3Cs2SO41.431.451.641.3Metrizamide1.121.141.171.27Nycodenz1.121.161.181.27沉淀系数的物理意义沉淀系数指单位离心力场（w2x）作用下的沉降速度（dx/dt），沉降系数的单位为秒蛋白质、脂蛋白、核糖体和病毒等的沉降系数介于1*10-13200*10-13秒。为方便起见把10-13秒作为1个单位，成为Svedberg单位区带离心和区带转子区带离心是指把样品中不同的颗粒分离成不连续的区带区带转
7、子是指一类结构与操作方式特殊的转子密度梯度离心速度-区带密度梯度离心法将样品置于一密度梯度介质顶层，该梯度最大密度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各物质按其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分离的方法。等密度梯度离心法等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的唯一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可用此法分离。转子类型
8、角转子甩平转子垂直转子规模化生产的超速离心机Optima L-100XP 100,000 rpm;802,400 x g Optima L-100K 100,000 rpm;802,400 x g Optima L-90K 90,000 rpm;694,000 x g Optima L-80XP 80,000 rpm;602,000 x g 密度梯度离心病毒颗粒的制备密度梯度离心病毒颗粒的制备密度梯度的加样量样品浓度过大，会产生液流，并且有可能产生沉淀。过高的浓度也会使分离区带变宽而丧失分辨率。当颗粒沉降系数或者浮力密度差较小时，上样体积不超过梯度体积的5%。梯度斜度越大，承载的样品量也越大。
9、比如10-50%梯度的最大上样量要比5-20%梯度的最大上样量大。对于区带转子，样品浓度低于起始梯度浓度的40%。蔗糖密度梯度离心离心时间的影响（改变颗粒移动的时间）密度梯度的影响（改变介质的密度，从而改变颗粒的移动速度）离心温度（改变离心介质的粘度，从而改变颗粒移动速度）仅通过蔗糖密度梯度离心很难得到EV71病毒颗粒的纯品，在此体系中条件优化不能实现质的提高CsCl等密度梯度离心的条件摸索密度梯度和取样编号密度g/mL抗原U/mL蛋白浓度mg/mL比活U/mg1(25-30-35-40%)-31.0581.291030.55762.32(25-30-35-40%)-51.104-6.470-
10、3(25-30-35-40%)-61.123-10.54-4(25-30-35-40%)-71.166-6.573-5(25-30-35-40%)-81.197-3.502-6(25-30-35-40%)-101.2241.431058.51016.87(25-30-35-40%)-111.2861.471040.821117.98(25-30-35-40%)-121.3627.861030.232733.89(20-40-60%)-31.0321.031031.1150.910(20-40-60%)-41.0607.891033.3752.311(20-40-60%)-51.081-12.8
11、2-12(20-40-60%)-61.149-15.69-13(20-40-60%)-71.2682.1510516.1013.414(20-40-60%)-81.3833.721040.914940.615(20-40-60%)-91.4947.371030.054491351 2 M 3 4 5 6 7 89 10 11 M 12 13 14 15等密度离心介质的筛选样品密度g/mL抗原U/mL蛋白浓度mg/mL比活U/mg1NaI第5管1.356104027520.42KI第10管1.322-3474-3KI第11管1.379-511.9-4KI第12管1.418-211.7-5NaBr
12、第8管1.29253875345015.66NaBr第9管1.3333453358.29.67NaBr第10管1.379146328.8350.72 3 4 M 5 6 7注：KBr在4C下结晶析出，所以没有考察采用NaBr代替昂贵的重金属盐CsCl，为EV71的纯化提供了一个新的途径！单元操作超滤单元操作超滤膜分离特点膜分离特点膜分离技术是用半透膜作为分离层，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能源等优点。膜分离的驱动力是膜两侧溶液状态的差别。膜两侧的压力（微滤、超滤、反渗透）、浓度（透析、渗透蒸发）、
13、电位（电渗析）等的差别均可作为分离的驱动力。微滤和超滤微滤和超滤微滤的分离原理为筛分原理，膜的孔径为0.0510m，采用的压力为0.050.5MPa。微滤技术主要用于消毒、澄清、细胞收集等过程。超滤的分离主要也是筛分原理，但有些情况下受到粒子荷电性的影响。超滤膜的孔径为0.0010.05m，它可以分离分子量从3k到1000k Da的可溶性大分子物质，采用的压力为0.11MPa。超滤技术主要用于浓缩，也可以用于分离过程，但是分离效率不高。当目标蛋白质与杂质的分子量差别达到一个数量级时，才可能用超滤技术实现有效的分离。影响分离的因素影响分离的因素n膜的类：包括膜的材料，膜孔的大小，膜的内部结构以及
14、膜组件的类型等。n操作条件：包括膜两侧压差、切向流速和温度等。n溶液环境：包括蛋白质浓度、物料的pH值、盐的类型及其浓度等。浓度极化浓度极化A:过滤，被膜阻挡物质在膜表面积累，形成浓度梯度B:切向流动使膜表面积累的物质在剪切作用下返回液流当A速度B速度时：在膜面附近形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓度极化可逆过程，在过滤中产生，停止过滤，极化逐渐消失AB曲线代表被膜阻挡物质的浓度变化，在距离膜表面处形成边界层，浓度呈指数形式增加膜的污染膜的污染物料中微粒、物料中微粒、胶体粒子或胶体粒子或溶质大分子溶质大分子膜膜物理化学或物理化学或机械作用机械作用膜孔径变小膜孔
15、径变小或堵塞或堵塞膜透过流量膜透过流量分离特性分离特性不可逆改变不可逆改变与初始纯水透水率相比，可降10%到80%层析的分类层析的分类吸附解吸类蛋白质分子与介质有相互作用离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析非吸附解吸类蛋白质分子与介质之间没有相互作用体积排阻层析：根据分子大小进行分类吸附解吸类层析吸附解吸类层析配基的类型决定色谱的模式Affinity(Biorecognition)生物识别Reversed phase(Hydrophobicity)疏水相互作用HIC(Hydrophobicity)疏水相互作用Ion exchange(Charge)电荷SOOO层析的影响因素层析的
16、影响因素 溶液pH 溶液温度 溶液盐浓度 溶质浓度 介质粒径大小 介质粒径分布 孔径大小 孔径分布常用的基本概念常用的基本概念 固定相 流动相 分配系数（Cs/Cm）分辨率（Rs=1每种组分纯度为98%；Rs=1.5每种组分纯度为99.8%）容量因子（D）：固定相与流动相中溶质量的分布比 分离因子（）：两种组分容量因子之比 操作容量：某种组分与固定相反应达到平衡时，介质的饱和容量；通常上样量应少于20%的操作容量JB GF 1998-06-0434Resolution RsRs=4Rs=0.6Rs=1RVVWWsrr21122Resolution=Peak separationAv.peak
17、widthJB GF 1998-06-0434Resolution RsRs=4Rs=0.6Rs=1RVVWWsrr21122Resolution=Peak separationAv.peak width速率方程各项的意义速率方程各项的意义smmsdeHHHHHHHCuuBAuDdCDdCDdCuDCdHmpsmmpmsfsmdp2222 为塔板高度pedH2eH 为涡流扩散相uDCHmdddH 为纵向扩散相uDdCHsfss2sH 为固定相传质阻力相uDdCHmpmsm2smH 为滞留流动相传质阻力相uDdCHmpmm2mH 为流动相传质阻力相液相色谱系统组成液相色谱系统组成动力系统进样系统
18、分离系统检测系统记录系统凝胶过滤层析凝胶过滤层析Gel filtration(Porath,Flodin,1959)Size exclusion chromatography(Pedersen,1962)Molecular sieve chromatography(Hjertn,Mosbach,1962)Gel permeation chromatography(Moore,1964)JB GF 1998-06-0424Steric exclusion leads to early elutionMolecules elute in order of size.The largestmolec
19、ules come first;the smallestones come last.凝胶过滤层析的用途凝胶过滤层析的用途分析柱用途制备柱用途确定分子量大小确定样品纯度研究蛋白质的结构脱盐缓冲液置换在蛋白质分离中常作为精制步骤去除DNA，以及小分子等杂质在病毒分离中作为第一步去除大部分分子量较小的杂质GF基本操作程序基本操作程序平衡上样洗脱一般来说上样体积应低于5%的柱体积，对于分析柱，则不超过1%的柱体积凝胶过滤层析中的基本概念凝胶过滤层析中的基本概念JB GF 1998-06-0426Terms and explanationsVoid volumeVoVolume of the gel
20、matrix VsPore volume ViVo=Void volumeVr=Elution volume within the separation range of the gelVi=Inner pore volume=Vc-Vs-VoVc=Total(geometric)volume of the column231VoVrVtVc分离度和柱效分离度和柱效JB GF 1998-06-0434Resolution RsRs=4Rs=0.6Rs=1RVVWWsrr21122Resolution=Peak separationAv.peak widthJB GF 1998-06-0446V
21、)N=5.54(WhrN=Number of theoretical platesTest:1%solution of acetone(about 0.5%of column volume),0.2 AUFS at 280 nm.Alternatively use 2 M NaCland conductivity monitor.EfficiencyWh=Peak width at half peak heightVrAU2802介质的特点介质的特点琼脂糖A good gel for gel filtration contains about95%water影响凝胶过滤层析的因素影响凝胶过滤层
22、析的因素介质种类和颗粒大小样品体积和浓度流速孔径大小颗粒大小的影响颗粒大小的影响p Superdex Peptide 13-15 mp Superdex 30 prep grade 24-44 m样品体积对于分辨率的影响样品体积对于分辨率的影响蛋白Tf和IgG的进样体积对分离精度的影响样品浓度的影响样品浓度的影响使用注意事项使用注意事项凝胶过滤层析最好使用进口层析柱装柱技术非常关键，有条件尽量使用预装柱对于某些分析柱，调节盐浓度可能会产生提高分辨率的效果蛋白质的吸附解吸类层析蛋白质的吸附解吸类层析蛋白质与小分子吸附解吸过程的最大不同：蛋白质不同的构象之间的能量差别较大，小分子则很小或没有蛋白质
23、吸到介质以后，除非改变流动相条件，否则不会解吸下来，会越吸牢固蛋白质更倾向于吸附机理，小分子更倾向于分配机理平衡进料淋洗洗脱再生平衡操作程序离子交换层析离子交换层析pH值 缓冲溶液类型洗脱盐的类型介质粒径介质孔径配基类型配基密度影响因素根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离离子交换层析的用途离子交换层析的用途步骤步骤纯度纯度 further removal of most proteins further removal of most nucleic acids further removal of endotoxins further removal of virusesinitial
24、 purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕获捕获2.中间纯化中间纯化可用于分离纯化的各个阶段第一步最常用有时也可以用于最后一步强和弱的区别强和弱的区别Weak anionexchangerWeak cationexchangerStrong anion exchangerStrong cation exchanger强弱在于它们的电荷基团完全解离的pH范围，强酸型在较大pH范围内完全解离，弱酸型完全解
25、离的pH范围较小强酸型离子交换剂对H+的结合能力比Na+小，弱酸型则反之强碱型离子交换剂对OH-的结合能力比Cl-小，弱酸型则反之常用的类型常用的类型葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 GE公司的Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流
26、速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和S系列常用的电荷基团常用的电荷基团 阴离子交换剂-Diethylaminoethyl(DEAE)-CH2CH2N+(CH2CH3)2-Quaternary aminoethyl(QAE)-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3-Quaternary ammonium(Q)-CH2N+(CH3)3阳离子交换剂-Carboxymethyl(CM)-CH2COO-Sulphopr
27、opyl(SP)-CH2CH2CH2SO3-Methylsulphonate(S)-CH2SO3pH值对蛋白质电荷的影响值对蛋白质电荷的影响Overall charge on protein+-NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acid isoelectric point alkalineexcess positive charge balanced positive and negative charge excess negative chargepHpH310利用利用pH值提高选择性值提高选择性Charge on protein-+pH310Anion exchange
28、rCation exchanger不同缓冲体系的缓冲能力不同缓冲体系的缓冲能力 To ensure a proper pH value,the sample should be dissolved in buffer A,(critical with large volume samples).Buffering ion concentrations of 2050 mM are usually sufficient.AUvolumepH valuegradientvolumeAUpH valuegradient阴离子交换可选缓冲体系阴离子交换可选缓冲体系pH456789101112N-Met
29、hylpiperazinePiperazineL-HistidineBis-TrisBis-Tris-propaneTriethanolamineTrisN-methyldiethaneEthanolamine(hi)Piperazine(hi)1,3-diaminoPiperidineBufferPrep AIEX阳离子交换可用缓冲体系阳离子交换可用缓冲体系pH0246810Maleic acidMalonic acidCitric acidFormic acidButanedioic aciAcetic acidMESMOPSPhosphateHEPESBICINEBufferPrep C
30、IEX使用使用pH值应注意的地方值应注意的地方蛋白质带电不均一，pH在等电点之下时，蛋白质整体带正电，但是也存在带有负电的基团，所以也可能和阴离子交换层析发生作用；阳离子层析也是如此pH值筛选过程值筛选过程1.先考察不同蛋白质稳定的pH范围确定可使用的pH值2.静态实验考察蛋白发生的吸附的pH值进一步缩小pH值范围1)Put 1 ml ion exchanger into several tubes 2)Add buffers with different pHs3)Add sample,mix4)Analyse the supernatants for the protein of inte
31、restHere the target binds completely at pH 7.5 and above.Conclusion:Anion exchanger,initial pH 7.5.pH值筛选过程值筛选过程3.通过层析选择最佳的pH值根据目标是分析还是分离，指标是纯度还是收率进行选择01020304050020406080100120mAUElution volume(ml)M NaCl10.50pH 5pH 6pH 7pH 8pH 9pH scouting for the separation of pancreatinConditions:System:KTAexplore
32、r 100,BufferPrepColumn:RESOURCE Q,6 mlSample:2 mg crude pancreatin不同的洗脱方式不同的洗脱方式阶跃梯度(Step gradient)线性梯度(Linear gradient)综合pH梯度盐梯度联用pH 和盐简单，易实现标准方法，分离精度高省时、效率高很少用标准方法灵敏，但难控蛋白质层析中的线性洗脱和阶梯洗脱蛋白质层析中的线性洗脱和阶梯洗脱进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果盐类型的影响盐类型的影响不同盐浓度具有相同洗脱力:Sulphate(SO42-)150 mM Chloride(Cl-)350 mM Acetate(C
33、H3COO-)700 mM阴离子对于阳离子层析，以及阳离子对阴离子层析也会有影响hofmeister效应离子交换层析小结离子交换层析小结原理如何筛选最佳pH值洗脱盐的影响其它操作细节（如平衡柱体积，温度，蛋白质与介质表面的接触时间等等）疏水相互作用层析疏水相互作用层析pH值 盐的类型盐的浓度介质粒径介质孔径配基类型配基密度影响因素根据蛋白质与介质之间疏水相互作用的强弱进行分离疏水层析的用途疏水层析的用途步骤步骤纯度纯度 further removal of most proteins further removal of most nucleic acids further removal o
34、f endotoxins further removal of virusesinitial purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕获捕获2.中间纯化中间纯化用于分离纯化的头两个阶段最后一步很少用疏水配基类型的影响疏水配基类型的影响丁基辛基低密度苯基高密度苯基相同配基类型，不同配基密度可使蛋白质的层析行为有很大的差别盐浓度的影响盐浓度的影响盐浓度过低蛋白质不能够与介质发生吸附盐浓度过高蛋白质吸附太强
35、，在柱上变性盐类型的影响盐类型的影响Cl-之前的称为kosmotropes（water structure maker）Cl-之前的称为chaotropes（water structure breaker）Franz HofmeisterFranz Hofmeister(18501922)不同离子对于蛋白质沉淀的影响（1888）对于早期的蛋白质纯化是基础性和指导性的工作 最早认识到蛋白质是由氨基酸组成的科学家（1902）是溶液化学的基础和核心问题 Hermann Emil Fischer(1952-1919)证明蛋白质是由氨基酸组成的科学家（1902）疏水层析最佳条件的选择疏水层析最佳条件的选
36、择1 考察不同盐对于蛋白质在溶液中稳定性的影响疏水层析最佳条件的选择疏水层析最佳条件的选择2 静态吸附筛选能够实现有效吸附的盐类盐上清中的活性解吸后的活性(NH4)2SO48.03%36.3%Na2SO46.72%43.1%NaCl16.0%28.2%KCl15.4%13.4%NH4Cl17.2%18.5%KNO316.8%5.76%KBr17.3%7.02%A/B7.55%39.7%只有三种盐的吸附效果比较好，其它的盐虽然在溶液中对HBsAg的活性没有损失，但是对HBsAg没有明显的吸附效果疏水层析最佳条件的选择疏水层析最佳条件的选择A/B抗原收率纯化倍数1/331.0%2.581/152.
37、0%3.822.6/163.0%6.457/174.6%5.10介质/破碎液抗原收率 纯化倍数1：440.6%12.21：687.2%25.81：861.6%16.21：1038.5%7.78盐类型调电导收率层析收率总收率(NH4)2SO468.6%60.1%41.2%Na2SO475.6%37.0%27.9%A/B77.4%76.4%59.1%盐比例浓度的影响 载量的影响盐类型的影响盐浓度的影响电导率抗原收率纯化倍数65.1mS/cm70.1%7.2374.3mS/cm89.8%1079.9mS/cm103%8.653 动态层析的进一步优化反相层析简介反相层析简介反相层析和疏水层析的差别反相
38、层析是目前分辨率最高分析类色谱亲和层析亲和层析亲和层析是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术优点：易于分离其它方法难以分离的样品单步纯度往往可达到95%以上易于从大量杂质或类似物杂质中分离出特定目的蛋白速度快应用广泛单抗、多抗、融合蛋白、酶、DNA结合蛋白亲和层析的关键在于配基的选择典型的洗脱图形典型的洗脱图形平衡进料淋洗洗脱再平衡配基的选择配基的选择Mono-specific ligandsSpecific for a single substance:Antigenantibody HormonereceptorGroup-specific ligandsSpecific for a
39、group of structurally or functionally similar substances:Lectins glycoproteins Protein G IgG antibodies Dye-stuffs enzymes纯化不同物质需要不同配基,一般不具有通用性多数情况下特殊生物活性分子无现成商品介质可供使用选择合适的配基是关键常用配基类型常用配基类型LigandSpecificityProtein AFc region of IgGProtein G Fc region of IgGConcanavalin AGlucopyranosyl&Mannopyranosyl
40、 groupsPeanut LectinTerminal galactose groupCibacron BlueBroad range of enzymes,serum albuminProcion RedNADP+dependent enzymes LysinePlasminogen,ribosomal RNA基质的选择基质的选择在多孔性、稳定性、机械强度等方面与IEC等介质相同必须易于活化但又必须具有一定惰性以防非特异性吸附基质物化性质不应与配基分子键合后发生显著改变颗粒均一度要求高，以保证配体分子均匀分布影响亲和层析的因素 基质的选择（乙肝病毒表面抗原亲和层析）配基的选择特异性、可逆性
41、、稳定性、配基分子大小 化学间臂的选择消除空间位阻、长度、亲水性介质与配基的键合基质表面活化-化学反应，如CNBr活化琼脂糖羟基 介质活化基团与配基上的氨基、羧基、羟基、巯基或醛基等发生共价结合反应键合过程应用实例单克隆抗体Sample:600 ml mouse monoclonal IgG 2aGel:rProtein A Sepharose Fast FlowElution:20 mM Sodium Citrate,pH 4.0Result:83 mg Mab,recovery 95%AU2.01.51.00.50.00200400600Volume(ml)Starting materia
42、lEluate94KD67KD43KDSDS-PAGE reduced应用实例组氨酸标记融合蛋白Sample:5 ml cytoplasmic extract containing(His)6-tagged GSTColumn:In HisTrap kitElution:Phosphate buffer,500 mM imidazole,pH 7.4Result:4 ml eluted GST-(His)6,A280:1.65.Total amount:4.5 mgStarting materialFlow-throughEluted GST-(His)6GST standardSDS-PAG
43、E94.067.043.030.020.114.4第二部分应用部分分离纯化在生物药品中的作用血液制品分离纯化技术是核心技术疫苗给正常人群使用，对其要求非常严格。在某些类产品中，分离纯化是技术难题生物制剂分离纯化是最关键技术之一细胞破碎液离心机疏水层析凝胶过滤层析离子交换层析脱盐浓缩纯化流程示意图关于纯化技术认识误区只要在蛋白上加上一个标签，就可以用金属螯合进行纯化，是否还需要其它技术？重组技术的局限性：分子量越大的蛋白质，重组蛋白与天然蛋白在结构上的差别越大，如重组的VIII因子以及重组疫苗 亲和层析技术的局限性：主要应用于实验室研究，在复杂体系中仍然会吸附其它的杂蛋白，存在着配基脱落关于纯度
44、的认识误区不仅要看纯度，还要看均一性以及结构是否正确。如大肠杆菌表达产物的N端非均一性，包涵体的复性等等。纯度受分析方法精确度的限制。如说纯度达到99.9%，必须说明所采用的分析方法以供判断是否可靠分离纯化过程中纯度可用于评价分离效果但不一定代表产品质量。蛋白质纯化的核心问题蛋白质在纯化过程中的结构变化HBsAg的DEAE层析谱图HBsAg的二级结构变化HBsAg的四级结构变化HBsAg在界面上变化的在线监测HBsAg纯品在离子交换层析上会分裂为两个峰，这说明其结构在层析中可能会发生变化层析技术的分类吸附解吸类非吸附解吸类离子交换层析；疏水相互作用层析；反相层析；亲和层析凝胶过滤层析（体积排阻
45、效应）高速逆流层析（两相分配）优点：分辨率高 缺点：存在吸附 优点：没有吸附 缺点：分辨率高蛋白质纯化与小分子纯化的差别蛋白质分子不同构象之间存在能量差别，吸附到表面后会朝自由能减少的方向变化。若不改变洗脱条件，被吸附的蛋白质永远不会被洗脱下来。小分子不同构象之间的能量差别很小。不改变洗脱条件，小分子也能被洗脱下来，只是需要的时间比较长进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果温度的影响 温度对体系平衡状态有影响 温度越高对蛋白结构变化速率有影响123456.56.66.76.86.97.0 273.15K 275.65K 278.15K 280.65K 283.15K Linear fit
46、of data for 273.15K Linear fit of data for 275.65K Linear fit of data for 278.15K Linear fit of data for 280.65K Linear fit of data for 283.15Kln(protein amount)Time(min)温度对HBsAg在层析介质表面解聚速率的影响不同温度对于病毒颗粒纯化效果的影响停留时间的影响停留时间，A：0min；B：30min；C：60min；D：90min02468101214160102030D Absorbance at 280nm(mAU)Tim
47、e(min)024681012141601020 C 024681012141601020 B 024681012141601020P2 AP1蛋白质与介质表面接触的时间越长，发生结构变化的蛋白所占比例越多，或者发生的结构变化越明显盐的类型和浓度的影响Cl-之前的称为kosmotropes（water structure maker）Cl-之前的称为chaotropes（water structure breaker）盐的类型对于层析的影响非常复杂Hofmeister序列中靠前例子容易使HBsAg在溶液中聚集，但是能够使其吸附于疏水层析介质上；序列中靠后的盐在溶液中对HBsAg稳定，但是不能够
48、使其发生有效吸附。混合使用两种盐可以使HBsAg吸附再介质表面，又不会发生太大的结构变化盐的类型对于HBsAg的影响载量的影响进料量对于HBsAg收率的影响进料量对于HBsAg结构的影响随着单位面积上蛋白质的吸附量，蛋白质分子之间拥挤作用可以减少其结构变化。层析过程的放大放大过程受到反应和传质两个方面的影响吸附诱导的反应和蛋白与介质的接触时间有关，由体积流速决定传质包括宏观流动和分子扩散两个方面，由线性流速决定保持柱子高度不变，扩大直径，按照线性流速放大可以保证反应和传质都不发生变化分离纯化三步曲步骤步骤纯度纯度 further removal of most proteins further
49、 removal of most nucleic acids further removal of endotoxins further removal of virusesinitial purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕获捕获2.中间纯化中间纯化综合考虑各种因素n 最小化操作体积最小化操作体积n 最少化操作步骤最少化操作步骤n 组合不同机理分离技术组合不同机理分离技术分辨率分辨率处理量处理量
50、回收率回收率速度速度重组乙肝病毒表面抗原纯化工艺IntermediatePurificationCCSButul-S Sephros 4FFDEAE Sepharose FFSepharose 4FFCapturePolishing最终纯品的鉴定多种手段综合表征表征二级结构其它性质三级结构（侧链微环境）四级结构远紫外圆二色谱红外光谱拉曼光谱凝胶过滤高效液相多角度激光散射动态光散射分析离心荧光光谱院子外圆二色谱二硫键、糖基化、N末端等等颗粒大小以及分布表面电势蛋白在表面上结构的原位表征H-D交换双偏振极化干涉原子力显微镜几个常被忽略的注意事项一定要先查阅文献，再开展实验。不要马上对介质和实验条件
