1、第四章第四章人工种子与植物脱毒人工种子与植物脱毒Contents1.人工种子人工种子2.植物脱毒植物脱毒4.1 愈伤组织与人工种子愈伤组织与人工种子 愈伤组织愈伤组织人工种子人工种子Callus and Artificial Seed4.1.1 愈伤组织愈伤组织 Callus 基本概念基本概念 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 愈伤组织的器官发生愈伤组织的器官发生一、基本概念一、基本概念 指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的均匀一致、无序生长的薄壁细胞团，具有分化的均匀一致、无序生长的薄壁细胞团，具有再分化能力。再分化能力。Callus consi
2、sts of an amorphous(无定形无定形)mass of loosely arranged thin-walled(parenchyma 薄壁薄壁)cells外植体（外植体（explant）：从植物体上分离下来的用于：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物器官和组织的切段离体培养的植物器官和组织的切段 Wound callus on the stemof an Erythrina tree 刺桐树刺桐树 Callus原意：植原意：植物受损伤时在愈合物受损伤时在愈合伤口处长出的一团伤口处长出的一团瘤状突起，突起内瘤状突起，突起内的细胞已发生脱分的细胞已发生脱分化的变化。化的变化。基本
3、概念基本概念 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 愈伤组织的器官发生方式愈伤组织的器官发生方式4.1.1 愈伤组织愈伤组织 Callus二、愈伤组织的诱导二、愈伤组织的诱导 从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期期：起动期 （诱导期）、分裂期和形成期（分（诱导期）、分裂期和形成期（分化期）。化期）。三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。平均大小都有明显的差别。一般植物组织都能诱发愈伤组织；诱导愈伤组织的成败关键主要一般植物组织都能诱发愈伤组织；诱导愈伤组织的成败关键主要不是实
4、验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素因素Stage 1.Induction（诱导期诱导期）:诱导期是细胞准备分裂的时期，诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈伤组织形成是愈伤组织形成起点。起点。外植体细胞在完整植株中随着细胞的外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程分化过程而而逐渐逐渐停止分裂停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞静止细胞。特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成代谢
5、迅速代谢迅速进行，但是细胞的进行，但是细胞的大小大小仍然和外植体时仍然和外植体时一样，一样，没有多大改变没有多大改变。诱导期的长短：诱导期的长短：由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定。（光照、外源激素）因素决定。例如菊芋的诱导期有时还不需要例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则要天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从发生改变。从11月到次年月到次年4月取菊芋块茎进行培养，月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从则诱导期从22小时逐渐延长到小时逐渐延长到4
6、0小时。小时。Stage 1.Induction（诱导期诱导期）:故故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短主要主要外因方面是添加一些生长物质外因方面是添加一些生长物质Steward等等(1964)用用2,4-D及其类似的生长调节物及其类似的生长调节物质处理处于静止状态的组织，看到质处理处于静止状态的组织，看到RNA的含量很的含量很快明显地增加。并且快明显地增加。并且2、4-D积累在分裂细胞的核积累在分裂细胞的核仁中。仁中。Yeoman 和和 Mitchell(1970)指出了指出了核仁是生长物核仁是生长物质的作用部位质的作用部位。Stage 1.Indu
7、ction（诱导期诱导期）:Brown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行进行DNA复制，全部细胞进入复制，全部细胞进入S期，并发生同步分裂。期，并发生同步分裂。Stage 1.Induction（诱导期诱导期）:Stage 2.Cell division 分裂期分裂期
8、Active cell division,cells revert to a meristematic dedifferentiated state.分裂期分裂期：外植体中外植体中已分化的活细胞已分化的活细胞在在外源激素外源激素的作用下，的作用下，外植体外植体外层细胞外层细胞出现了分裂，由于外层细胞的出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂迅速分裂使使得这些细胞的得这些细胞的体积缩小体积缩小，逐渐回复到，逐渐回复到分生组织状态分生组织状态，因此，因此也称为也称为回复变化回复变化。在回复变化时，细胞通过。在回复变化时，细胞通过脱分化脱分化的起动的起动期而进入期而进入分裂，分裂，并开始并开始形成愈伤组织
9、。形成愈伤组织。特征特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是：生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行外层细胞进行分裂分裂，而，而中间的细胞不分裂中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等积变小；细胞核和核仁增到最大等Stage 2.Cell division 分裂期分裂期 形成的愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明Stage 2.Cell division 分裂期分裂期Stage 3.Differentiation 分化期分化期 Appearance of cellular differentiatio
10、n and the e x p r e s s i o n o f secondary metabolic pathways.分化期特点分化期特点：分化结构的形成过程加速，超过分化结构的形成过程加速，超过了回复变化了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为停止，为次生生长所代替次生生长所代替，大量，大量次生结构次生结构出现。出现。在这时期中在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡细胞的伸展和分裂处于平衡，故细，故细胞的胞的平均大小平均大小往往没有变化。往往没有变化。Stage 3.Differentiation 分化期分化期Callus types Callus
11、may be heavily lignified（木质化木质化）and hard in texture,whereas others break easily into small fragments(friable).Different types of Gloriosa callus:Friable Hard/lignified callus Callus may have a yellow,white,green or red(anthocyanin 花青苷花青苷)appearance.不同颜色的愈伤不同颜色的愈伤Stage 3.Differentiation 分化期分化期 基本概念基本
12、概念 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 愈伤组织的器官发生方式愈伤组织的器官发生方式第一节第一节 愈伤组织愈伤组织 Callus三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式愈伤组织培养物在某些条件下：愈伤组织培养物在某些条件下：可以可以再分化再分化产生不定芽或根的分生组织产生不定芽或根的分生组织 甚至是甚至是胚状体胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成继之，由这些有结构的组织而发育成苗苗或完整小植株或完整小植株。1、愈伤组织通过不定芽方式、愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生再分化形成再生植株的方式植株的方式主要有三种：主要有三种：（1）先产生先产生芽，芽，后在茎的基部长后在茎的基部长根
13、根；（2）先长）先长根根，再长，再长芽芽；（3）愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。）愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式 器官分化的植物激素控制理论：器官分化的植物激素控制理论：大多数植物组织或器官的再生作用符合器官大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。分化的植物激素控制理论。生长素与细胞分裂素生长素与细胞分裂素比例小比例小时则产生时则产生芽芽比例大比例大时则生时则生根根比例适中比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。时，则产生无结构的愈伤组织。三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式2、体细胞胚的发生、体细胞胚
14、的发生 愈伤组织愈伤组织 体细胞胚体细胞胚 植株植株三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式一般愈伤组织开始分化时，由一般愈伤组织开始分化时，由大小不等大小不等的细胞开始逐渐形的细胞开始逐渐形成成大小均匀的细胞大小均匀的细胞，保持，保持相对稳定相对稳定状态。状态。在分化时，愈伤组织的在分化时，愈伤组织的表层和内部表层和内部都可形成都可形成分生中心分生中心。芽芽多发生在愈伤组织的多发生在愈伤组织的表层表层，属，属外起外起源。源。根根发生在组织的发生在组织的深处深处，与整体植株发生类似，是，与整体植株发生类似，是内起源内起源。愈伤组织
15、的愈伤组织的外部形态也随分化而改变外部形态也随分化而改变，一般由，一般由疏松转向紧疏松转向紧密密。三、愈伤组织的器官发生方式三、愈伤组织的器官发生方式4.1 人工种子人工种子 Artificial Seed 人工种子概述人工种子概述 人工种子的制备人工种子的制备 人工种子的应用人工种子的应用一、人工种子概述一、人工种子概述1 1、早期（传统的）人工种子的概念、早期（传统的）人工种子的概念可由愈伤组可由愈伤组织、悬浮细织、悬浮细胞、花粉、胞、花粉、原生质体等原生质体等发生！发生！种子的结构种子的结构人工种子的结构人工种子的结构研究历史研究历史2、现代人工种子的概念、现代人工种子的概念2、现代人工
16、种子的概念、现代人工种子的概念根据繁殖体的类型分三类根据繁殖体的类型分三类A A、体细胞胚培养、体细胞胚培养传统方法传统方法B B、微型营养器官繁殖体培养、微型营养器官繁殖体培养根据繁殖体的类型分三类根据繁殖体的类型分三类温度温度 马铃薯18-20光照光照 马铃薯短培养基渗透压培养基渗透压 马铃薯8蔗糖激素激素 与内源激素水平变化和平衡有关地黄根茎半夏块茎马铃薯块茎C C、微芽繁殖体培养、微芽繁殖体培养根据繁殖体的类型分三类根据繁殖体的类型分三类4.1 人工种子人工种子 Artificial Seed 人工种子概述人工种子概述 人工种子的制备人工种子的制备 人工种子的应用人工种子的应用二、人工
17、种子的制备二、人工种子的制备 体细胞胚的诱导体细胞胚的诱导 人工胚乳的制备人工胚乳的制备 人工种皮的制备人工种皮的制备关键：体细胞胚胎发生的同步化控制！关键：体细胞胚胎发生的同步化控制！二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备人工胚乳的成分？人工胚乳的成分？二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备二、人工种子的制备用褐藻酸钙水溶性胶囊包埋胚状体，图褐藻酸钙水凝胶法示意图包囊体在水中洗用以生产人工单胚种子称水凝胶法二、人工种子的制备二、人工种子
18、的制备制作人工种子的示意图制作人工种子的示意图4.1 人工种子人工种子 Artificial Seed 人工种子概述人工种子概述 人工种子的制备人工种子的制备 人工种子的应用人工种子的应用三、人工种子的应用三、人工种子的应用存在的存在的问题问题 人工种皮性能不尽人意；还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳；胚状体储藏阶段的休眠控制；如何保证长期储藏而又不影响萌发率；制作流程较繁琐、成本高。许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。5.人工种子应用举例人工种子应用举例 一品红人工种子制作一品红人工种子制作v 为什么要制备人工种子：一品红又名圣诞花，属大朗科，常绿溜木。是在元旦和圣诞节前夕观赏
19、的一种著名盆栽花卉。一品红常采用扦插繁殖，繁殖速度慢。v如何制备人工种子：v器官发生途径：目前多以叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织，再分步诱导芽和根，生成苗。v体细胞胚途径：以苞片为外植体，离体诱导体细胞胚，制作人工种子。v下面介绍这种方法。注意不同生长素/分裂素比例对于体细胞胚诱导的影响。v（1）愈伤组织诱导：v将一品红苞片常规消毒，切成0.6cm2小块，接种到添加不同浓度6-BA和2，4-D的MS培养基中（表1），每瓶接种5片称重，第20天继代培养时再称重。培养温度25度左右，暗培养。2，4-D/6-BA比例较高时比例较高时(2.0/0.5)有利于愈伤组织诱导有利于愈伤组织诱导2 2，4-D
20、4-D：2 2，4-4-二氯苯氧乙酸（生长素）二氯苯氧乙酸（生长素）6-BA6-BA：6-6-苄基腺嘌呤（分裂素）苄基腺嘌呤（分裂素）（2 2）体细胞胚诱导）体细胞胚诱导降低生长素降低生长素2，4-D浓度浓度(1.0/0.5)：体细胞胚分化率升高：体细胞胚分化率升高活性炭吸附减轻酚氧化的褐变，也有促进萌发效果活性炭吸附减轻酚氧化的褐变，也有促进萌发效果（3）包埋与萌发）包埋与萌发海藻酸盐法海藻酸盐法v 胚状体悬浮在3%的海藻酸钠+1/2MS培养基+6-BA0.5mg/L（分裂素）+GA3(赤霉素)0.5mg/L+IBA0.5mg/L（生长素）+1.5%麦芽糖的混合液中(赤霉素是生长调节剂，能促
21、进不定胚发育成小植株)v 滴入到2%氯化钙溶液里，络合15分钟，捞起，无菌水洗涤，干燥成一定强度的人工种子胶丸。v 播种在无激素的MS培养基上，25度，光照2000lx，12小时/天，30天后计算萌发率。1球形胚 2心形胚 3犁形胚 4子叶期胚 5人工种子 6人工种子萌发Contents1.人工种子人工种子2.植物脱毒植物脱毒4.2 植物脱毒植物脱毒 植物脱毒植物脱毒 为什么？（植物病毒及其危害）为什么？（植物病毒及其危害）怎么脱毒（方法）？怎么脱毒（方法）？如何鉴定？如何鉴定？一、植物病毒及其危害一、植物病毒及其危害TMVtobacco mosaic virus 病毒学的发展简史病毒学的发展
22、简史1798年年 接种牛痘预防天花接种牛痘预防天花1885年年 制成狂犬疫苗制成狂犬疫苗1892年年 Ivanofsky因发现因发现烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（TMV）时，时，称其为滤过性致病因子称其为滤过性致病因子（第一个被发现的病毒）（第一个被发现的病毒）1935年年 获得获得TMV的结晶的结晶1939年年 电镜下观察到电镜下观察到TMV1967年年 阐明病毒的本质阐明病毒的本质1970年年 发现逆转录病毒发现逆转录病毒1982年年 发现朊病毒（羊瘙痒病）发现朊病毒（羊瘙痒病）1983年年 分离到分离到AIDS相关病毒相关病毒1997年年 发现疯牛病致病因子是朊病毒发现疯牛病致病因子是朊病
23、毒 一种病毒可侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。当病毒侵染寄主植物后，感病植物代谢异常，使植物的叶片黄化，褪绿，皱缩，卷曲；使植株矮化，坏死；使果实减少或畸形。植物病毒的危害植物病毒的危害 变色：花叶、黄化 坏死 畸形：叶片皱缩、叶缘卷曲、果面凹凸不平，植株矮化植物病毒的危害植物病毒的危害Potato Spindle tuber植物病毒的危害植物病毒的危害马铃薯晚疫病菌在爱尔兰岛蔓延，导致大量马铃薯腐烂爱尔兰饥荒（爱尔兰饥荒（1845-1849年）年）大约有100万爱尔兰人不是饿死，便是病死；还有100万人逃到英格兰、北美这是什么花？美丽的郁金香与植物病毒病美丽的郁金香与植物病毒病
24、第一个记载的植物病毒病当属郁金香碎色花病，因为至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆还保存着一张1619年荷兰画家的一幅得病的郁金香静物画。为什么要画得病的郁金香呢？学过经济史的人都记得，资本主义历史上第一场泡沫经济发生在学过经济史的人都记得，资本主义历史上第一场泡沫经济发生在17世纪的荷世纪的荷兰。引发危机的主角，不是兰。引发危机的主角，不是“COM”，而是郁金香。，而是郁金香。郁金香属多年生草本球根花卉。土耳其是最早栽培郁金香的国家。郁金香的郁金香属多年生草本球根花卉。土耳其是最早栽培郁金香的国家。郁金香的原名原名“Tulipa”就是土耳其语就是土耳其语“美丽的头巾美丽的头巾”之意。郁金香虽无食用和药
25、用价值，之意。郁金香虽无食用和药用价值，但它具有独特的观赏价值。但它具有独特的观赏价值。1554年，郁金香传到欧洲。年，郁金香传到欧洲。1594年春天，郁金香第一次在荷兰的林登植物园年春天，郁金香第一次在荷兰的林登植物园绽放。从此，郁金香开始利用国色天香，实施诱惑和控制人类的战略。到绽放。从此，郁金香开始利用国色天香，实施诱惑和控制人类的战略。到1623年，年，一颗名为一颗名为“Semper Augustus”的种球，身价已到的种球，身价已到13000枚银币。枚银币。16341637年是年是“郁金香狂热期郁金香狂热期”。郁金香族群抓住机遇，大力推行科技兴。郁金香族群抓住机遇，大力推行科技兴郁战
26、略。郁金香黑客们合作编写了一段病毒程序，使单色的郁金香出现色纹裂变。郁战略。郁金香黑客们合作编写了一段病毒程序，使单色的郁金香出现色纹裂变。这种变色郁金香使这种变色郁金香使“哈郁族哈郁族”如痴如醉，得到一颗变色郁金香种球比获得一颗珠如痴如醉，得到一颗变色郁金香种球比获得一颗珠宝还高兴，更有发烧友竟以一座酿酒厂去换取一颗种球。顷刻之间，变色郁金香宝还高兴，更有发烧友竟以一座酿酒厂去换取一颗种球。顷刻之间，变色郁金香身价暴涨，成为稀世珍宝。投机商们借机大肆炒作，大发横财。不久，有人破译身价暴涨，成为稀世珍宝。投机商们借机大肆炒作，大发横财。不久，有人破译了变色病毒程序，并大量复制和传播。刹那之间，
27、变色郁金香身价暴跌，大批变了变色病毒程序，并大量复制和传播。刹那之间，变色郁金香身价暴跌，大批变色种球的大户和散户被套牢，荷兰的资本主义经济蒙受了惨重损失。色种球的大户和散户被套牢，荷兰的资本主义经济蒙受了惨重损失。4.2 脱毒植物的培育脱毒植物的培育 植物脱毒植物脱毒 为什么？（植物病毒及其危害）为什么？（植物病毒及其危害）怎么脱毒？怎么脱毒？如何鉴定？如何鉴定？二、植物脱毒的原理和技术二、植物脱毒的原理和技术1 1、原理：、原理：病毒在植物体内的分布不均匀（病毒在植物体内的分布不均匀（茎尖培养茎尖培养）通过维管组织传播（通过维管组织传播（珠心组织培养珠心组织培养）2 2、方法：、方法：传统
28、防治方法：传统防治方法：物理方法物理方法：X射线、紫外线和高温等处理，使病毒钝化，抑制蔓延射线、紫外线和高温等处理，使病毒钝化，抑制蔓延 化学方法化学方法：抑制剂，如8-鸟嘌呤、病毒唑等 生物学方法生物学方法：抗病毒品种（如转基因）分生组织培养法：分生组织培养法：V i rus el i m i nati onw hy does the m eri stem have l ow/no vi rus ti tre?vi rus spreads pri m ari l y through vascul ar system -thi s i s not devel oped i n the m er
29、i stem m i tosi s and chrom osom e repl i cati on com pete w i th vi rus repl i cati on hi gh auxi n i n m eri stem i nhi bi ts vi rus repl i cati on a vi rus“i nacti vati ng”system has greatest acti vi ty i n m eri stemT obacco m eri stemvi rus-freeti ssuevi rus parti cl esfound here物理方法热处理原理：病毒和宿主
30、对高温的耐受性有差异，在植物原理：病毒和宿主对高温的耐受性有差异，在植物受到高温伤害前杀死病毒或使病毒活性有效钝化。受到高温伤害前杀死病毒或使病毒活性有效钝化。三、植物脱毒的技术规程三、植物脱毒的技术规程1、被脱毒植物携带病毒的诊断2、母体材料的选择和预处理3、茎尖分生组织培养再生植株4、脱毒效果检测5、脱毒苗的保存与繁殖4.2 脱毒植物的培育脱毒植物的培育 植物脱毒植物脱毒 为什么？（植物病毒及其危害）为什么？（植物病毒及其危害）怎么脱毒？怎么脱毒？如何鉴定脱毒是否成功？如何鉴定脱毒是否成功？三、植物脱毒效果的检测（病毒鉴定）三、植物脱毒效果的检测（病毒鉴定）再生植株后，一般应在18个月以内
31、进行病毒检测，因为病毒在植物体内的潜伏期一般在612个月。病毒检测的主要方法：病毒检测的主要方法：指示植物鉴定 血清学鉴定1、指示植物鉴定（、指示植物鉴定（indicator plant test）Test plants：用以鉴别病毒或其株系的具有特定反应的植物。方法：汁液摩擦接种 特点：症状产生快、稳定 具有特征性症状 只能定性不能定量2、血清学技术、血清学技术蛋白衣壳的抗原特性：抗原抗体反应琼脂双扩散技术酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immuno sorbent assay,Elisa)3、电镜技术、电镜技术(Electron Microscopy)v超薄切片 v负染技术v免疫电镜技术烟草花叶病毒（杆状）烟草花叶病毒（杆状）4 4、核酸杂交及、核酸杂交及PCRPCR技术技术v核酸杂交技术：探针vPCR技术马铃薯脱毒试管苗马铃薯脱毒试管苗影响脱毒效果的因素
