1、植物组织培养的基本方法目的要求目的要求1一般掌握灭菌和消毒的区别2掌握灭菌的方法和具体操作过程3掌握无菌接种的步骤 4掌握外植体的选择、培养方法和步骤5一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法6掌握试管苗驯化的基本程序7一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法 灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等
2、不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。1培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序按容器大小不同，保压时间有所不同（下
3、表）。容器的体积（ml）在121灭菌所需最少时间（min）2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160180的温度来杀死微生物。通常采用170 持续90分钟来灭菌。4.不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌（1）紫外线灭菌在接种室、
4、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。（2）熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛。6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用7
5、0的酒精反复涂擦灭菌，的来苏儿溶液以及0.25的新洁尔灭也可以。7.植物材料表面用消毒剂灭菌外植体的选择:外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。外植体的灭菌方法:植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。第二步是对材料的表面浸润灭菌。第三步是用
6、灭菌剂处理。最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗310次左右。常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。灭菌剂使用浓度持续时间(min)去除的难易 效果次氯酸钙90-100g/l530易很好次氯酸钠5-20g/l530易很好漂白粉饱和溶液530易很好氯化汞0.1-10g/l2-10较难最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好过氧化氢100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素450mg/L3060
7、中较好接 种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。接种前后的程序：A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手；C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗最后沥去水分，取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。培养培养：指把培养材料放在培养室（有光照
8、、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。（一）培养方法1固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。2液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50100转分，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。静止培养：滤纸桥培养振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架(二）培养步骤：1初代培养：即接种某种外植体后
9、，最初的几代培养。初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。（1）顶芽和腋芽的发育采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子萌发后取枝条也可以。（2）不定芽的发育在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。多数情况下它先形成芽，后形成根。另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法不能无性繁殖的种类，
10、在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基，如非洲菊、草莓等。（3）体细胞胚状体的发生与发育2继代培养：在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达
11、到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。3生根培养：生根培养是使无根苗生根的过程。最后要使生出的不定根浓密而粗壮。生根可采用1/2或者14 培养基，全部去掉或用低浓度的细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IAA等)。当新梢高达3cm以上时切除基部的愈伤组织。用下列方法诱导生根（1）将新梢基部浸入50或100ppm IBA溶液中处理48小时。（2）在含有生长素的培养基中培养46天。（3）直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根。但前二种方法对新生根的生长发育更有利。而第三种对幼根的生长有
12、抑制作用。因为当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。试管内生根壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，使试管苗适应外界的环境因子。不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以1820为宜。温度过高牵涉到蒸腾加强。以及菌类易滋生等问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活春季低温时苗床可加设电热线使基质温度略高于气温203，这利于生根和促进根系发达，有利于提前成活。光强应比以前培养有所提高。以强度较高的漫射光为好，约4000Lx左右为宜，以维持光合作用所需光强。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。培养物污染原因和预防措施1、污染：是指在组织培养过程中由于
13、真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。2、原因：培养基及各种使用器具消毒不彻底，外植体灭菌时不彻底，操作时人为因素带入，工作区域污染等。3、控制：器具在高温灭菌后，在使用过程中需要不断地在酒精灯上进行灼烧消毒；所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的预培养，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加抗生素来抑菌。初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体
14、有变褐色而死亡的现象。原因：很多植物都含有较多的酚类化合物，其在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在细胞受到伤害时，分隔效应被打破，酚类化合物外溢，与多酚氧化酶接触而氧化成褐色的醌类物质和水。醌类物质在酶的作用下，与外植体中的蛋白质聚合，从而使其它酶失活，组织代谢活动紊乱，生长停滞。影响因素1、植物种类和基因型：木本植物、单宁或色素含量高的植物易发生褐变；2、外植体的来源和生理状况：幼龄材料一般比成龄材料褐变轻（含酚类物质少）；同一植物冬春季取材褐变死亡率最低，其它季节不同程度增加；3、外植体的大小：小材料更易褐变，大材料切口越大，酚类氧化面越大，易褐变；消毒的化学试剂也会
15、引起褐化；4、培养基：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。5、培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。控制褐变的措施1、外植体和培养材料进行20-40天的遮光处理或暗培养，可减轻部分种类的褐化程度；2、在接种前用无菌水反复清洗外植体并对外植体进行冷藏处理，洗尽切口处渗出的酚类物质，可起到减轻褐化作用；3、控制温度和光照，在不影响正常生长和分化的前提下，尽量降低温度，减少光照；4、在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化
16、剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。在培养基中加入0.5-1%左右的活性炭，用以吸附褐变产生的有害物质，减轻褐变影响；5、连续转移：对容易褐变的材料可间隔1224小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理710天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。继代培养时材料的玻璃化 定义：当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化为试管苗的生理失调症。玻璃苗的特点：叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔；体内含水量高，但干物质叶绿素、蛋白质、纤维素和木
17、质素含量低。诱因（P40）1、激素浓度：当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象；2、温度3、湿度4、培养基的硬度5、光照时间6、培养基成分 C/N解决的方法（1）增加琼脂浓度，提高蔗糖含量，可增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；（2）减少培养基中含氮化合物的用量；（3）增加光照；（4）增加容器通风，降低培养容器内部环境的相对湿度；（5）降低培养温度，进行昼夜变温交替培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；（6）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的含量，可以考虑加入适量脱落酸。试管苗移栽驯化试管苗移栽是组织培养的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽
18、，应该选择适用合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个工作有条不紊地进行。必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。从叶片上看，试管苗叶片表面角质层不发达或没有，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛。叶片上甚至出现了大量的水孔，此外，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境，当将它们移栽到正常环境中时，试管苗失水率很高，非常容易死亡。为了要改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须要经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有
19、：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。此外，对栽培驯化基质要灭菌因为试管苗是在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高成活率，可以在培养基质中掺入 75的百菌清可湿性粉剂 200500倍液，以进行灭菌处理。过程（一）移栽基质的准备适合栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，不利于杂菌滋生，可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时按比例搭配，一般用珍珠岩：蛭石：草炭土为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用最少3小时烘烤来消灭其
20、中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。（二）栽培容器准备栽培容器可用661010的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用再移，后者需要二次移苗，但省空间省基质。（三）移苗和幼苗的管理从试管取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，以减少伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入注意幼苗较嫩，要防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。栽后给予较高的空气湿度条件。首先营养钵的培养土要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减少水分的蒸腾
21、，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当发现小苗有生长趋势，可逐渐减少湿度将拱棚两端打开通风，并且减少喷水次数。使小苗适应湿度较小的条件。以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，少浇水或不浇水，促进小苗长得粗壮。温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是1620，春季地温较低时，可用电热线来加温。光照管理上初期可用较弱的光照，在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用，后期可直接利用自然光照。要注意防止菌类滋生。用一定浓度的杀菌剂可以有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津等，有死苗现象就是由于杂菌引起的，喷药宜710天喷一次；喷营养液作追肥，可加快苗的生长与成活；开始给予比较弱的光照。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。
