生物制品分析概论课件.ppt

1、生物制品分析概论生物制品分析概论 第二军医大学药学院第二军医大学药学院编辑ppt本章内容本章内容 背景概述背景概述 鉴别试验鉴别试验 杂质检查杂质检查 含量（效价）测定含量（效价）测定编辑ppt第一节第一节 背景概述背景概述 生物药物（生物药物（Biopharmaceutics或或Biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，是利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。的原理与方法制得的一大类药物。广义的生物药

2、物应包括从动物、植物和微生物等生物广义的生物药物应包括从动物、植物和微生物等生物体中直接制取的各种天然生物活性物质以及人工合成体中直接制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。或半合成的天然物质类似物。一、生物药物与生物制品一、生物药物与生物制品编辑ppt生物药物发展生物药物发展 第一代生物药物：利用第一代生物药物：利用生物材料加工制成生物材料加工制成的含有某些的含有某些天然活性物质与混合成分的粗提物制剂天然活性物质与混合成分的粗提物制剂 甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊等其肠溶片、肠溶

3、胶囊等 第二代生物药物：根据生物化学和免疫学原理，第二代生物药物：根据生物化学和免疫学原理，应用应用近代生化分离纯化技术近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分疗作用的特异生化成分尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子球蛋白、人凝血因子、人纤维蛋白原、人纤维蛋白原编辑ppt生物药物发展生物药物发展 第三代生物药物：应用第三代生物药物：应用生物工程技术生产生物工程技术生产的天然生理的天然生理活性物质，以及通过活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造蛋白质工程原理设计

4、制造的具有的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。同的全新的药理活性成分。重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素 1b、重组、重组人白细胞介素人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素（、重组人红细胞生成素（EPO）等）等生化药物生化药物生物合成药物生物合成药物生物制品生物制品生物药物分类生物药物分类编辑ppt生物药物分类生物药物分类 生化药物生化药物:一般系指从动物、植物及微生物提取的，一般系指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制

5、得的化学半合成或用现代生物技术制得的生生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等物等，如，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、核苷酸类脂质、核苷酸类等。等。生物合成药物生物合成药物:由由微生物代谢微生物代谢所产生的药物和必须利所产生的药物和必须利用用微生物及其酶转化反应微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物，如共同完成的半合成药物，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、氨基酸、维生素、氨基酸、维生素、生物碱、甾体激素、抗生素生物碱、甾体激素、抗生素和一些核苷酸、

6、酶与辅酶和一些核苷酸、酶与辅酶类药物等。类药物等。编辑ppt生物药物分类生物药物分类 生物制品生物制品:以以微生物、细胞、动物或人源组织和体液微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。类疾病的预防、治疗和诊断。生长激素释放抑制激素的生产：生长激素释放抑制激素的生产：10万只羊下丘脑万只羊下丘脑1mg10L大肠杆菌工程菌株发酵液大肠杆菌工程菌株发酵液核酸疫苗制备技术路线：核酸疫苗制备技术路线：目的抗原基因的选择与分离目的抗原基因的选择与分离与载体与载体DNA连接连接转入宿转入宿主扩增

7、质粒主扩增质粒重组质粒提取重组质粒提取、纯化与后处理、纯化与后处理编辑ppt二、生物制品的种类与特点二、生物制品的种类与特点 疫苗类药物疫苗类药物细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类毒素毒素 抗毒素及抗血清类药物抗毒素及抗血清类药物破伤风抗毒素等破伤风抗毒素等 血液制品血液制品人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原 生物技术制品生物技术制品 重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重组人组人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等 微生态活菌制品微生态活

8、菌制品如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等 诊断制品诊断制品体外诊断制品（体外诊断制品（HBsAg酶联免疫诊断试剂酶联免疫诊断试剂盒）、体内诊断试剂盒）、体内诊断试剂编辑ppt二、生物制品的种类与特点二、生物制品的种类与特点 分子量不定值分子量不定值不同的相对分子质量产生不同活性不同的相对分子质量产生不同活性 生化法结构确证生化法结构确证定期监测制品肽图定期监测制品肽图 需检查生物活性需检查生物活性生物检定法证实活性生物检定法证实活性 安全性检查安全性检查宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量

9、 效价测定效价测定酶活力测定酶活力测定编辑ppt三、生物制品全程质量控制三、生物制品全程质量控制注射用重组链激酶产品的全程质量控制过程注射用重组链激酶产品的全程质量控制过程操作过程操作过程具体项目具体项目法定标准法定标准1 1 基本要求基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等水、器具、动物等符合符合“凡例凡例”的有关要求的有关要求2 2 制造制造2.1 2.1 工程菌菌种工程菌菌种名称与来源名称与来源带有链激酶基因的重组质粒带有链激酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株转化的大肠杆菌菌株种子批的建立、菌种检定种子批的建立、菌种检定应符合规定应符合规定2.

10、2 2.2 原液原液种子液制备、发酵用培养基种子液制备、发酵用培养基应符合规定应符合规定种子液接种及发酵培养种子液接种及发酵培养按工艺操作按工艺操作发酵液处理、初步纯化、高度纯发酵液处理、初步纯化、高度纯化化按工艺操作，纯度符合规定按工艺操作，纯度符合规定原液检定原液检定按按3.13.1项进行项进行2.3 2.3 半成品半成品配制与除菌、半成品检定配制与除菌、半成品检定工艺按规定操作，检定按工艺按规定操作，检定按3.23.2项进行项进行2.4 2.4 成品成品分批、分装与冻干、规格、包装分批、分装与冻干、规格、包装应符合规定应符合规定编辑ppt3 3 检定检定3.1 3.1 原液检定原液检定生

11、物学活性、蛋白质含量、比活性生物学活性、蛋白质含量、比活性依法测定，应符合规定依法测定，应符合规定纯度纯度电泳法、电泳法、HPLCHPLC测定，纯度不测定，纯度不低于低于95.095.0分子量分子量还原型还原型SDS-PAGESDS-PAGE法测定，为法测定，为47.047.0 4.70kD4.70kD外源性外源性DNADNA、宿主菌蛋白残留量以及、宿主菌蛋白残留量以及残留抗生素残留抗生素依法测定，应符合规定依法测定，应符合规定细菌内毒素细菌内毒素依法测定，应符合规定依法测定，应符合规定等电点等电点主区带应为主区带应为4.64.6 5.65.6紫外光谱扫描紫外光谱扫描最大吸收波长应为最大吸收波

12、长应为277277 3nm3nm肽图肽图依法测定，应与对照品图形依法测定，应与对照品图形一致一致N-N-末端氨基酸序列末端氨基酸序列Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-AspLeu-Leu-Asp3.2 3.2 半成品检定半成品检定细菌内毒素、无菌检查细菌内毒素、无菌检查依法测定，应符合规定依法测定，应符合规定3.3 3.3 成品检定成品检定鉴别试验、物理检查、化学检定鉴别试验、物理检查、化学检定依法测定，应符合规定依法测定

13、，应符合规定生物学活性生物学活性应为标示量的应为标示量的8080 150150无菌、细菌内毒素、异常毒性检查无菌、细菌内毒素、异常毒性检查依法测定，应符合规定依法测定，应符合规定编辑ppt对生物制品的质量控制重点对生物制品的质量控制重点 有效成分的同一性、结构确证；有效成分的同一性、结构确证；有效成分的均一性、纯度检验；有效成分的均一性、纯度检验；有害物质及残余杂质（特殊杂质）等的控制；有害物质及残余杂质（特殊杂质）等的控制；高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法。高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法。为了正确反映生物制品的性质与特性，生物制品质为了正确反映生物制品的性质与特性，生物制品质量

14、控制的基本方法一般应包括鉴别试验、杂质检查、量控制的基本方法一般应包括鉴别试验、杂质检查、安全性检查和含量（生物学活性或效价）测定。安全性检查和含量（生物学活性或效价）测定。编辑ppt第二节第二节 鉴别试验鉴别试验 依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用利用化学法、物理法及生物学方法化学法、物理法及生物学方法进行某些进行某些特殊反应特殊反应，或测定某些或测定某些专属的理化常数专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证产品的真伪

15、。产品的真伪。需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。生物制品的鉴别不是由一项试验就能完成，而是依据生物制品的鉴别不是由一项试验就能完成，而是依据其特异的分子结构和其特异的分子结构和(或或)其他特性其他特性(包括理化性质和生包括理化性质和生物学活性等物学活性等)设计一组试验来全面评价一种药物设计一组试验来全面评价一种药物。编辑ppt一、理化鉴别法一、理化鉴别法 化学法：化学法：通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。蛋白质类生物制品蛋白质类生物制品

16、蛋白质变性反应蛋白质变性反应胰蛋白酶胰蛋白酶+对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐精氨酸甲酯盐酸盐紫色紫色胃蛋白酶胃蛋白酶+鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液沉淀沉淀 紫外分光光度法：紫外分光光度法：蛋白质类生物制品的紫外吸收光谱是由于芳香族氨基酸侧链，蛋白质类生物制品的紫外吸收光谱是由于芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收的结果。主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收的结果。对于一个蛋白或多肽分子来说，它的最大吸收波长是固定的，对于一个蛋白或多肽分子来说，它的最大吸收波长是固定的，不同批次产品的紫外光谱图也应该是一致的。不同

17、批次产品的紫外光谱图也应该是一致的。编辑ppt一、理化鉴别法一、理化鉴别法 高效液相色谱法：高效液相色谱法：基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中主峰主峰保留时间和肽图的一致性保留时间和肽图的一致性，可用于目的产品的鉴别。可用于目的产品的鉴别。重组人粒细胞集落刺激因子重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后的经胰蛋白酶裂解后的RP-HPLC（左）和（左）和CZE（右）肽图典型谱图（右）肽图典型谱图 编辑ppt一、理化鉴别法一、理化鉴别法 示例：示例：胰岛素的鉴别胰岛素的鉴别 （1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品）在含量测定项

18、下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。时间一致。（2）取本品适量，用）取本品适量，用0.1三氟醋酸溶液制成每三氟醋酸溶液制成每lml中含中含10mg的溶液，取的溶液，取20l，加，加0.2mol/L三羟三羟甲基氨基甲烷甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液盐酸缓冲液(pH7.3)20l、0.1V8酶溶液酶溶液20l与水与水140l，混匀，置，混匀，置37水浴水浴2小时小时后，加磷酸后，加磷酸3l，作为供试品溶液；另取胰岛素对，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照品适量，同法制备，作为对照品溶液。l编

19、辑ppt一、理化鉴别法一、理化鉴别法 照含量测定项下的色谱条照含量测定项下的色谱条件，以件，以0.2mol/L硫酸盐缓硫酸盐缓冲液冲液(pH2.3)-乙腈乙腈(90:10)为流动相为流动相A，乙腈，乙腈-水水(50:50)为流动相为流动相B，按右，按右表进行梯度洗脱。取对照表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各品溶液和供试品溶液各25l，分别注入液相色谱，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。溶液的肽图谱一致。时间时间（分钟）（分钟）流动相流动相A（%）流动相流动相B（%）0 90 10 60 55 45

20、70 55 45编辑ppt二、生化鉴别法二、生化鉴别法 酶法：酶法：利用酶对底物特异性的催化活力，可以作为酶利用酶对底物特异性的催化活力，可以作为酶类生物制品简便、快速、灵敏的鉴别方法。类生物制品简便、快速、灵敏的鉴别方法。尿激酶的鉴别尿激酶的鉴别：尿激酶尿激酶 用巴比妥用巴比妥-氯化钠缓冲液氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解溶解 成成1ml(含含20单位单位)+牛纤维蛋白原牛纤维蛋白原溶液溶液0.3ml 再依次加入再依次加入牛纤维蛋白溶牛纤维蛋白溶酶原酶原溶液溶液0.2ml，牛凝血酶牛凝血酶溶液溶液0.2ml，迅速摇匀，立，迅速摇匀，立即置即置37 0.5恒温水浴恒温水浴中保温，记时，反应系统应

21、中保温，记时，反应系统应在在30s 45s内凝结，且凝块在内凝结，且凝块在15min内重新溶解。内重新溶解。以以0.9氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。内不溶。编辑ppt二、生化鉴别法二、生化鉴别法 电泳法：电泳法：应用电泳技术如等电聚焦电泳、应用电泳技术如等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等，）等，获获得目的产品的一致性、同一性的电泳图谱和数得目的产品的一致性、同一性的电泳图谱和数据，据，可用于蛋白质类生物制品的鉴别。可用于蛋白质类生物制品的鉴别。等电聚焦电泳用于检测蛋白质类生物制品的等电点，等电聚焦电泳用于

22、检测蛋白质类生物制品的等电点，例如中国药典例如中国药典2010年版三部收载的重组人干扰素年版三部收载的重组人干扰素 1b、2a、2b和和 等电点，依法测定，主区带应等电点，依法测定，主区带应分别为分别为4.0 6.5、5.5 6.8、4.0 6.7和和8.1 9.1。编辑ppt二、生化鉴别法二、生化鉴别法 示例：示例：重组人生长激素的鉴别重组人生长激素的鉴别 取本品，加水溶解制成每取本品，加水溶解制成每1ml中含中含1mg的溶液，的溶液，取此溶液取此溶液90l，加两性电解质，加两性电解质10l和甲基红试液和甲基红试液2l，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生

23、长激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各照品溶液和供试品溶液各10l，加至上样孔，照，加至上样孔，照等电聚焦电泳法（附录等电聚焦电泳法（附录 F第六法）试验，供试第六法）试验，供试品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。编辑ppt三、生物鉴别法三、生物鉴别法 血清学法血清学法 体外抗原抗体试验。抗原抗体反应具有体外抗原抗体试验。抗原抗体反应具有高度的特异性，只要一方已知，即可检高度的特异性，只要一方已知，即可检测出另一方。如测出另一方。如凝集反应、沉淀反应、凝集反应、沉淀反应、中和反

24、应和补给结合反应，中和反应和补给结合反应，以上四种类以上四种类型反应即所谓的经典血清学反应。型反应即所谓的经典血清学反应。编辑ppt三、生物鉴别法三、生物鉴别法 示例：示例：人血白蛋白的鉴别人血白蛋白的鉴别 采用免疫双扩散技术，依法测定（附录 C），供试品仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊的血清不产生沉淀线。选择免疫电泳技术，依法测定（附录 D），供试品与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白。编辑ppt三、生物鉴别法三、生物鉴别法 生物学法生物学法 利用生物体对生物制品特定的生物活性利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别即为生的反应为基础进行供试品的鉴别

25、即为生物学法。物学法。编辑ppt三、生物鉴别法三、生物鉴别法 示例：示例：注射用重组人促红素（注射用重组人促红素（CHO细胞）细胞）人促红素具有刺激网织红细胞生成的生物作用。人促红素具有刺激网织红细胞生成的生物作用。给小鼠皮下注射供试品后，其血液中网织红细给小鼠皮下注射供试品后，其血液中网织红细胞的数量随着人促红素注射量的增加而升高。胞的数量随着人促红素注射量的增加而升高。因此，中国药典因此，中国药典2010年版三部收载的注射用重年版三部收载的注射用重组人促红素（组人促红素（CHO细胞），其原液的检定依据细胞），其原液的检定依据人促红素独特的生物学活性，即采用网织红细人促红素独特的生物学活性，

26、即采用网织红细胞法。胞法。编辑ppt第三节第三节 杂质检查杂质检查 生物制品的杂质检查可用来判定产品的优劣。一般地，生物制品的杂质检查可用来判定产品的优劣。一般地，只要在不影响临床疗效及人体健康的原则下，药品质只要在不影响临床疗效及人体健康的原则下，药品质量标准可以允许生产过程和贮藏过程中引入的微量杂量标准可以允许生产过程和贮藏过程中引入的微量杂质的存在。质的存在。生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品成分并化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品成分并非单一，非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，极

27、微量杂质可能产生显著的效应，因此，生因此，生物制品的杂质检查就显得尤为重要，涉及的项目也各物制品的杂质检查就显得尤为重要，涉及的项目也各有特点，主要包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安有特点，主要包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安全性检查。全性检查。编辑ppt一、特殊杂质检查一、特殊杂质检查 特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入的特特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入的特有杂质。有杂质。特殊杂质检查意义是特殊杂质可能存在的毒性会引起特殊杂质检查意义是特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题；可能影响产品的生物学活性和药理作用，安全性问题；可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质

28、；也反映产品生产工艺的稳定性。或使产品变质；也反映产品生产工艺的稳定性。生物污染物生物污染物微生物、外源性微生物、外源性DNA等等 产品相关杂质产品相关杂质二聚体，多聚体，突变物等二聚体，多聚体，突变物等 工艺添加剂工艺添加剂残余抗生素，甲醛，吐温残余抗生素，甲醛，吐温80，曲拉通，曲拉通X-114等等 编辑ppt（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量 中国药典中国药典2010年版均采用酶联免疫吸附剂测定法年版均采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的的基础

29、是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。酶标记。酶标板固相酶标板固相兔抗大肠杆菌菌兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体体蛋白抗体加入供试品加入供试品菌体蛋白与抗体结合菌体蛋白与抗体结合洗涤洗涤加入辣根过氧化酶标加入辣根过氧化酶标记的抗体记的抗体加入专一性底物，反应后加入专一性底物，反应后测定测定492nm吸光度值吸光度值菌体蛋白菌体蛋白含量含量编辑ppt 示例：示例：ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组法检测大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体蛋白含量制品中残留菌体蛋白含量 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体

30、表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。1、在测定时，受检标本、在测定时，受检标本(测定其中的残留菌体蛋白抗原测定其中的残留菌体蛋白抗原)与固与固相载体表面的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；相载体表面的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；2、通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中、通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开；的其他物质分开；3、加入辣根过氧化酶、加入辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗标

31、记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。编辑ppt 示例：示例：ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组法检测大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体蛋白含量制品中残留菌体蛋白含量 4、因此，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；、因此，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；5、加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物、加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关；的量与标本中受检物质的量直接相关；6、故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。、故可根据呈色的

32、深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法达到很高的敏感度，以保宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法达到很高的敏感度，以保证生物制品的安全有效。证生物制品的安全有效。编辑ppt 具体操作：具体操作：取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每成每1ml中含中含l0 g的溶液，以的溶液，以100 l/孔加至孔加至96孔酶标板内，孔酶标板内，4放置过夜放置过夜(16h 18h)。用洗涤液洗板。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制次；用洗涤

33、液制备备1牛血清白蛋白溶液，以牛血清白蛋白溶液，以200 l孔加至板内，孔加至板内，37放放置置2h；将；将封闭好的酶标板封闭好的酶标板用洗涤液洗板用洗涤液洗板3次；以次；以100 1孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同双孔，同时加入两孔空白对照时加入两孔空白对照(稀释液稀释液)，37放置放置2h；用稀释液稀；用稀释液稀释辣根过氧化酶释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以倍，以100 1孔加至板内，孔加至板内，37放置放置1h，用，用洗涤液洗涤液洗板洗板10次次，以，以100 1

34、孔加入底物液，孔加入底物液，37避光放置避光放置40min，以，以50 l孔孔加入终止液终止反应加入终止液终止反应。用酶标仪在。用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。和数据分析，也可使用手工作图法计算。以标准品溶液吸光度对相应的浓度作以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线标准曲线，并以供试，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量。品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量。编辑ppt（二）外源性（二）外源性DNA残留量残留量 随着生物技术的发展以及人们对细菌、病毒和细胞的

35、随着生物技术的发展以及人们对细菌、病毒和细胞的长期研究与不断认识，制造生物制品的宿主细胞（菌）长期研究与不断认识，制造生物制品的宿主细胞（菌）残留残留DNA（外源性（外源性DNA）的安全性问题逐步清晰，）的安全性问题逐步清晰，大大样本、长时间的临床试验进一步证实生物制品中外源样本、长时间的临床试验进一步证实生物制品中外源DNA不应该视为一个潜在的危险因素，不应该视为一个潜在的危险因素，而是作为生物而是作为生物制品中一个不纯的、应该去掉的杂质成份来对待，为制品中一个不纯的、应该去掉的杂质成份来对待，为此有关外源性此有关外源性DNA的限量要求也随之放宽。的限量要求也随之放宽。外源性外源性DNA的测

36、定方法目前主要有三种，即的测定方法目前主要有三种，即分子杂交分子杂交（Hybridization）技术）技术、基于基于DNA结合蛋白结合蛋白(Threshold)分析系统分析系统和和实时定量实时定量PCR（Q-PCR）方）方法法。编辑ppt生物制品中外源性生物制品中外源性DNA残留检测方法的比较残留检测方法的比较HybridizationThresholdQ-PCR特异性特异性物种特异性物种特异性无特异性无特异性序列特异性序列特异性检测的最小序列长度检测的最小序列长度(bp)50600150抗干扰性和稳定性抗干扰性和稳定性+所需时间（所需时间（h）4862灵敏度（灵敏度（pg）10632000

37、0560000编辑ppt（三）产品相关杂质（三）产品相关杂质 产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保存过程中产生的与产品结构类似的同系物、异构藏保存过程中产生的与产品结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。体、突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成分，产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成分，而且经验表明许多产品相关杂质是均匀的和非免疫原而且经验表明许多产品相关杂质是均匀的和非免疫原性的，但由于生物效应没有经过严格的安全性试验研性的，但由于生物效应没有经过严格的安全性试验

38、研究，应制定允许的限度加以控制。究，应制定允许的限度加以控制。常用的分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。常用的分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。编辑ppt示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质 取本品适量，用取本品适量，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0）制成）制成每每1ml中含重组人生长激素中含重组人生长激素1.0mg的溶液，作为供试品溶的溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。对照品溶液。照照分子排阻色谱法测定分子排阻色谱法测定，以适合

39、分离，以适合分离分子量为分子量为5000 60000球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂；异丙；异丙醇醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠磷酸二氢钠3.65g，加水，加水950ml，用，用85%磷酸溶液调节磷酸溶液调节pH值至值至7.0，加水至，加水至1000ml）（）（397）为流动相；流速为）为流动相；流速为每分钟每分钟0.6ml；检测波长为；检测波长为214nm。编辑ppt 取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（

40、磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取）（取0.063 mol/L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液12.5）制成每）制成每1ml中含中含1.0mg的溶液，取的溶液，取20l注入液相色谱仪，重组人生注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体的分离度应符合要求。长激素单体与二聚体的分离度应符合要求。取供试品溶液取供试品溶液20l注入液相色谱仪，记录色谱图，注入液相色谱仪，记录色谱图，按按面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过4.0%。编辑ppt（四）残余抗生素（四）残余抗生素 对于生物制品的制造工艺，原则上不主张使用抗生素。对于生物制品的制造工艺，原则上不主张使用抗生素

41、。例如中国例如中国药典药典2010年版三部收载的注射用重组人干扰素年版三部收载的注射用重组人干扰素 2a（酵母）和注（酵母）和注射用重组人促红素（射用重组人促红素（CHO细胞）产品生产的各个环节均严格限细胞）产品生产的各个环节均严格限制抗生素使用，故产品的检定包括原液、半成品、成品不必检查制抗生素使用，故产品的检定包括原液、半成品、成品不必检查残余抗生素活性。残余抗生素活性。如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺中去除，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测项目。中去除，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测项目

42、。依据中国药典依据中国药典2010年版三部附录年版三部附录A抗生素残留量检查法可以检抗生素残留量检查法可以检测残余氨苄西林或四环素的活性。测残余氨苄西林或四环素的活性。该法系依据在琼脂培养基内抗该法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残留量。检查供试品中氨苄西林或四环素残留量。编辑ppt二、安全性检查二、安全性检查 来自生物体的生物制品由于自身独特的大分子结构、来自生物体的生物制品由于自身独特的大分子结构、高效的生物活性以及制造、

43、纯化、贮藏过程带来的潜高效的生物活性以及制造、纯化、贮藏过程带来的潜在危险因素，使安全性检查成为生物制品质量标准中在危险因素，使安全性检查成为生物制品质量标准中的一个必不可少的检查项目，是保证临床用药安全、的一个必不可少的检查项目，是保证临床用药安全、有效的重要指标。有效的重要指标。中国药典中国药典(2010年版年版)对于生物对于生物制品安全性检查的主要项目包括以下几个方面：制品安全性检查的主要项目包括以下几个方面：无菌检查法、热原检查、细菌内毒素检查、异常毒性无菌检查法、热原检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查法、支原体检查法、病毒外源因子检查法、微生检查法、支原体检查法、病毒外源因子检查法、

44、微生物检查法和鼠源性病毒检查法。物检查法和鼠源性病毒检查法。编辑ppt第四节第四节 含量（效价）测定含量（效价）测定 理化分析法、生化测定法和生物检定法理化分析法、生化测定法和生物检定法 定量表征生物制品的方法通常有两种：定量表征生物制品的方法通常有两种：用百分含量表示用百分含量表示，适用于成分已知、结构明确，适用于成分已知、结构明确的生物制品的生物制品用生物效价或酶活力单位表示用生物效价或酶活力单位表示，适用于大多数，适用于大多数酶类和蛋白质类生物制品酶类和蛋白质类生物制品 编辑ppt一、理化分析法 滴定法：滴定法：示例：示例：胰酶中胰淀粉酶的测定胰酶中胰淀粉酶的测定 利用氧化还原反应，利用

45、氧化还原反应，以以1可溶性淀粉溶液为底物，经胰可溶性淀粉溶液为底物，经胰淀粉酶水解后产生还原糖，淀粉酶水解后产生还原糖，在碱性溶液中过量的碘滴定在碱性溶液中过量的碘滴定液氧化生成的还原糖，而剩余的碘滴定液用硫代硫酸钠液氧化生成的还原糖，而剩余的碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液滴定至无色。根据每滴定液滴定至无色。根据每1ml碘滴定液（碘滴定液（0.05 mol/L）相当于相当于9.008mg无水葡萄糖的滴定度来推算还原糖的含无水葡萄糖的滴定度来推算还原糖的含量，进而求得每量，进而求得每1g胰酶中含胰淀粉酶的活力（单位）。胰酶中含胰淀粉酶的活力（单位）。编辑ppt一、理化分析法一、理化分析法 光谱法：光

46、谱法：蛋白质制品的含量测定，既可以根据在蛋白质制品的含量测定，既可以根据在280nm左右有最左右有最大吸收直接测定，也可以利用大吸收直接测定，也可以利用蛋白质与双缩脲试剂发生蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应颜色反应而进行含量测定，选择的依据取决于测定方法而进行含量测定，选择的依据取决于测定方法的专属性、稳定性和简便性。的专属性、稳定性和简便性。中国药典中国药典2010年版二部收载的胰蛋白酶的效价测定是基年版二部收载的胰蛋白酶的效价测定是基于酶活力的选择性和底物产物的光谱特性，即根据胰蛋于酶活力的选择性和底物产物的光谱特性，即根据胰蛋白酶与底物白酶与底物N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯作用后生成的

47、产物在精氨酸乙酯作用后生成的产物在253nm处的吸收度值的变化来进行胰蛋白酶的效价测定。处的吸收度值的变化来进行胰蛋白酶的效价测定。编辑ppt一、理化分析法一、理化分析法 高效液相色谱法：高效液相色谱法：反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法测定重组人胰岛素的含量测定重组人胰岛素的含量 取本品适量，精密称定，用取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液盐酸溶液定量稀释至每定量稀释至每1ml中约含中约含10单位的溶液（临用新单位的溶液（临用新配）。精密量取配）。精密量取20 l注入液相色谱仪，记录色谱注入液相色谱仪，记录色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。图；另取重组人胰岛素对照

48、品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积计算，即得。按外标法以人胰岛素峰面积计算，即得。编辑ppt分子排阻色谱法（分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）也称凝胶色谱法（也称凝胶色谱法（gel chromatography），是），是快速分离不同分子量混合物的色谱方法，广泛应快速分离不同分子量混合物的色谱方法，广泛应用于多肽和蛋白质等生物制品的分离分析及其分用于多肽和蛋白质等生物制品的分离分析及其分子量的测定。子量的测定。分子排阻色谱柱常用的固定相是分子排阻色谱柱常用的固定相是亲水性有机凝胶亲水性有机凝胶（如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或（

49、如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶，流动相是可以溶解样品的低黏度缓冲改性硅胶，流动相是可以溶解样品的低黏度缓冲溶液或有机溶剂溶液或有机溶剂-缓冲液混合溶液等。缓冲液混合溶液等。编辑ppt分子排阻法应用特点分子排阻法应用特点（1）生物活性蛋白质可以回收制备。）生物活性蛋白质可以回收制备。（2）色谱分离是在固定比例的水溶液体系中进行的。）色谱分离是在固定比例的水溶液体系中进行的。（3）色谱分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有）色谱分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。效粒径而进行的。（4）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色谱图上一）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色

50、谱图上一般只能容纳般只能容纳10 12个色谱峰，分离度低。个色谱峰，分离度低。编辑ppt一、理化分析法一、理化分析法 示例：示例：分子排阻色谱法测定重组人生长激分子排阻色谱法测定重组人生长激素的含量素的含量 1、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量为为5000 60 000球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂；以异丙醇充剂；以异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠，磷酸二氢钠3.65g，加水，加水950ml，用，用85%磷酸溶液调节磷酸溶液调节pH值至值至7.0