1、实验五实验五 土壤中微生物的分离土壤中微生物的分离 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验器材实验器材 实验方法实验方法 注意事项注意事项思考题思考题微生物学实验微生物学实验-31了解微生物分离和纯化的基本原理。了解微生物分离和纯化的基本原理。2掌握常用的微生物分离纯化的方法。掌握常用的微生物分离纯化的方法。实验目的实验目的 实验原理实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化，常用的方法有两种：纯化，常用的方法有两种：1平板分离法（涂布法、混菌法）平板分离法（涂布法、混菌法）2划
2、线分离法划线分离法1.微生物样品：微生物样品：土壤土壤2.培养基：培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏1号培养号培养基，基，PDA培养基。培养基。3.溶液或试剂：溶液或试剂：盛盛9ml无菌水的试管，盛无菌水的试管，盛99ml无菌无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，水并带有玻璃珠的三角烧瓶，95%酒精。酒精。4.仪器或其他用具：仪器或其他用具：天平，玻璃涂布棒，移夜枪，天平，玻璃涂布棒，移夜枪，无菌枪头，接种环，无菌培养皿，记号笔等。无菌枪头，接种环，无菌培养皿，记号笔等。实验器材实验器材 1稀释涂布平板法稀释涂布平板法 倒平板倒平板 将固体培养基加热溶化，待冷却至将固体培
3、养基加热溶化，待冷却至5560时，时，在酒精灯火焰旁，将培养基迅速倒入已灭菌的在酒精灯火焰旁，将培养基迅速倒入已灭菌的培养皿中约培养皿中约1520ml，平放于桌面上，待冷却凝，平放于桌面上，待冷却凝固后即为无菌平板。固后即为无菌平板。实验方法实验方法倒平板操作示意图倒平板操作示意图 准确称取土壤样品准确称取土壤样品1g，放人盛有，放人盛有99ml无菌水并无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，振摇约放有小玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使，使微生物细胞分散，即成微生物细胞分散，即成10-2的土壤样品稀释液；的土壤样品稀释液；用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取10-2稀释液稀释液1mL，移入装有，移入装有
4、9mL无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即成均匀，即成10-3稀释液；再换一支无菌吸管吸稀释液；再换一支无菌吸管吸取取10-3稀释液稀释液1mL，移入装有，移入装有9mL无菌水的试无菌水的试管中，也吹吸几次，即成管中，也吹吸几次，即成10-4稀释液，以此类稀释液，以此类推，连续稀释，制成推，连续稀释，制成10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。等一系列稀释菌液。制备样品稀释液制备样品稀释液（以土壤为例）（以土壤为例）从土壤中分离微生物操作过程从土壤中分离微生物操作过程使用：使用：10-2、10-3、10-4枪头枪头卸枪头按钮
5、卸枪头按钮加样按钮加样按钮加样量显示窗加样量显示窗注意：注意：按下加样按按下加样按钮时要轻轻钮时要轻轻按下，注意按下，注意区别加样档区别加样档和排空档；和排空档；放开时要缓放开时要缓缓放松。缓放松。涂布涂布 在无菌平板的底部贴好标签，然后用无菌吸管在无菌平板的底部贴好标签，然后用无菌吸管分别由分别由10-2、10-3和和10-4 土壤样品稀释液中各吸土壤样品稀释液中各吸取一定量的稀释液（取一定量的稀释液（0.1ml0.2ml）对号放入已）对号放入已写好标签的无菌平板中，用无菌玻璃涂布棒在写好标签的无菌平板中，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下
6、静置510min，使菌液吸附进培养基。，使菌液吸附进培养基。涂布平板操作法示意图涂布平板操作法示意图混混菌菌法法涂涂布布法法培养基培养基约约55培养培养 将平板将平板倒置倒置于于28温箱中恒温培养，细菌培养温箱中恒温培养，细菌培养12 d，放线菌培养，放线菌培养57 d，霉菌，霉菌35 d。挑菌落挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述培养基的斜面上，置于到上述培养基的斜面上，置于28温箱培养，待温箱培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，若发现有杂菌苔长出后，检查其特征是否一致，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养菌，
7、需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养2.平板划线分离法平板划线分离法倒平板：倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，标明培养基名按稀释涂布平板法倒平板，标明培养基名称、样品编号和实验日期。称、样品编号和实验日期。划线：划线：点燃酒精灯，在火焰旁左手拿无菌平板，右点燃酒精灯，在火焰旁左手拿无菌平板，右手拿接种环以无菌操作沾取少许待分离的样品，手拿接种环以无菌操作沾取少许待分离的样品，在无菌平板表面进行平行划线、连续化线、交叉在无菌平板表面进行平行划线、连续化线、交叉划线、扇形划线、方格划线或其他形式的划线，划线、扇形划线、方格划线或其他形式的划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，微生物细胞数
8、量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。培养，挑单菌落培养，挑单菌落。平板划线平板划线操作法示意图操作法示意图平板划线分离法平板划线分离法(streak plate method)平板划线菌落分离效果图平板划线菌落分离效果图1341.在稀释混合平板法中，注入培养基不能太热，在稀释混合平板法中，注入培养基不能太热，否则会烫死微生物；在混匀时，动作要轻巧，否则会烫死微生物；在混匀时，动作要轻巧，应多次前后、应多次前后、左右、顺或逆时针方向
9、旋动。左右、顺或逆时针方向旋动。2.作涂布、划线用的平板，琼脂含量可适当高些，作涂布、划线用的平板，琼脂含量可适当高些，倒平板时培养基不宜太烫，否则易在平板表面倒平板时培养基不宜太烫，否则易在平板表面形成冷凝水，导致菌落扩散或蔓延。形成冷凝水，导致菌落扩散或蔓延。3.划线时动作要轻巧，避免划破平板。划线时动作要轻巧，避免划破平板。4.注意整个操作过程是在火焰周围的无菌操作区注意整个操作过程是在火焰周围的无菌操作区域内进行，操作完成后将接种工具火焰灭菌后域内进行，操作完成后将接种工具火焰灭菌后再放回原处。再放回原处。注意事项注意事项 1.涂布好的平板在培养时为何要倒置涂布好的平板在培养时为何要倒置?思考题思考题
