1、第十四章 平面色谱法,分析化学(下 第三版),一、概述 二、平面色谱技术参数 三、平面色谱固定相与制备 四、样品的制备与点样 五、平面色谱的展开 六、展开后处理与斑点定位 七、定性分析方法 八、纸色谱法简介 九、平面色谱法的特点及应用,主要内容,第一节 概述,平面色谱法(plane chromatography)是在平面上进行分离的一种色谱方法；主要包括薄层色谱法、纸色谱法和薄层电泳法。 一般过程： 铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量),平面色谱的分类及分离机理,纸色谱法（PC, paper chromatography）：属分配色谱 薄层色谱法(TLC, thin layer
2、chromatography)：吸附薄层、分配薄层、离子交换薄层、凝胶薄层 薄层色谱法：经典薄层、高效薄层(HPTLC)、高压薄层(OPTLC) 薄层电泳法(thin layer electrophoresis, 了解)：主要用于生物大分子（蛋白质、核酸、多肽、糖类）等带电荷的物质。,第二节 平面色谱的主要技术参数,一、定性参数 二、相平衡参数 三、面效参数 四、分离参数,一、定性参数(quality parameters),1. 比移值Rf (Retention factor),续前,讨论 Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关。 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关
3、，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为,续前,1）Rf范围：0 Rf 1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.20.8（常用） 0.30.5（最佳） 2) 影响Rf的因素:被分离物质的结构和性质,薄层板的性质,展开剂的性质,温度,展开剂蒸汽等,续前,2. 相对比移值Rs (了解),讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1,二、相平衡参数,相平衡参数：分配系数K和容量因子k,R表示单位时间内一个分子
4、在流动相中出现的几率，也可以表示组分分子在平面上移动的速度. RfL/L0=ut/u0t，定时展开时R Rf,讨论 Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板 和展开剂的性质有关，K大，Rf小 薄层板一定，Rf只与组分性质有关，对于极性组分， 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱） 展开剂极性小，Rf小 （不容易洗脱） Rf1 K或k=0 组分在前沿 Rf0 K或k= 组分在原点,（三）面效参数,1、理论塔板数 n=16(L/W)2 L:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度,2、塔板高度 H=L0/n L0：原点到展开剂前沿的距离 n越大，H越小。,（四）分离参数,1、分离度(resol
5、ution; R) 两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值,L1 、L2 :分别为原点至两半斑点中心的距离， W1、W2斑点的宽度。,2.分离数(separation number SN，了解),定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前沿)之间能容纳的色谱斑点数。 一般薄层板的分离数为 710，高效薄层板可达1020。SN是衡量分离容量的重要参数,第三节 平面色谱固定相与制备,一、平面色谱常用吸附剂(absorbent)： 多孔、微粒状物质,吸附能力与吸附中心的多少及氢键形成能力的大小有关 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺,1. 硅胶（SiO2H2O,
6、 silica gel）,结构：内部硅氧交联结构多孔结构 表面有硅醇基氢键作用吸附活性中心,特性： 1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性，吸附能力强极性吸附中心，不易洗脱 吸附活性次序：活泼型束缚型游离型 2）吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力,适用：分析酸性或中性物质,续前,2. 氧化铝 碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 45 适于分析酸性、中性物质,3. 聚酰胺 氢键作用 氢键能力强，组分比移值越小,二、吸附剂的选择原则,
7、根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂 被测物极性弱强极性吸附剂,三、薄层板的制备(preparation of the plate),定性分析窄条 定量分析1020cm,第四节 样品制备与点样,一、点样溶液的制备 二、点样方式与方法 三、点样工具,一、点样溶液的制备,由于平面色谱一般为一次性使用，故样品一般不需要复杂的前处理，应注意的几个问题有： 配制点样溶液的溶剂对样品的溶解度不宜过大，应尽量为有机溶剂，避免使用水； 根据方法的灵敏度，配制合适的供试品溶液的浓度（0.01%1.00%），必要时应进行稀释和浓缩； 选择合适的检测方式，可根据检测方法的不同，对样品进行必要的
8、前处理，如衍生 溶剂粘度不宜过高，且沸点适宜。,二、点样设备和点样方式,点状点样：是最为常用的点样方式。定性分析可选用内径为0.5mm管口平整的毛细管或微量注射器点样；定量分析可选用微量注射器或自动的微量点样装置进行。 带状点样：当样品溶液的体积大、浓度稀时，可采用自动的点样器进行带状点样，常用来进行制备分离。适用于定量制备分析。 自动点样（了解）：全自动点样装置结合了现代最先进的电子及机械技术，能进行点状点样或带状点样，采用计算机程序控制，灵活多用，定量结果精密准确。,特殊的点样方式（了解）,热微量抽提法：将一些药物进行微量升华等热微量分离转移技术与薄层色谱法连用的方法。此法的优点是大大缩短
9、了提取生药中挥发性成分前处理的时间，简化了提取方法，减少了样品用量，缺点是不宜用于非挥发性成分。此法亦可用于小量生药的半定量分析，生药成分的微量制备以及生药的指纹鉴定等。 流体提取法：物质在超临界流体中的溶解度由于压缩气体与溶质分子间相互作用加强而大大增加。改变温度和压力就可改变超临界流体的特性，因此可以分别在一定温度和压力条件下将不同极性的成分从样品中提取出来，并与薄层连用。此法主要应用于中药有效成分分析。,点状点样 a=20 mm b=15 mm c=10 mm,条状点样 a=20 mm b=15 mm c=10 mm d=5 mm,点样示意图,三、点样工具（了解）,第五节 平面色谱的展开
10、,一、展开剂的选择 二、展开方式 三、展开缸 四、影响展开的因素,一、展开剂的选择,选择原则： 在相似相容原则下，兼顾溶 剂的纯度、稳定性、粘度、蒸汽压以及毒性等性质,展开剂中各组分的作用（了解）,展开剂中比例较大的溶剂极性相对较小，起溶解溶质和基本分离的作用，一般称为底剂。 展开剂中比例较小的溶剂，极性较大，对被分离物质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动，可以增大比移值，但不能提高分辨率，可称为极性调节剂。 展开剂中加入少量酸、碱，可抑制某些酸、碱性物质或其盐类的解离而产生斑点拖尾，称为拖尾抑制剂。 展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂，可促使不相混合的溶剂混溶，并可降低展开剂的粘度，加快展速
11、，助溶剂。,二、展开方式,线性展开 上行展开 下行展开 双向展开 近水平展开 环形展开：适用于比移值较小的组分展开 多次展开 单向多次 增量多次展开 阶式展开 连续展开 分离反应分离 超压薄层 旋转薄层,上行展开,纸色谱下行展开装置,不同种元胡多次展开薄层色谱图,第一次展开,第二次展开,第三次展开,三、展开缸,展开缸的底部必须平整，薄层板放入后能呈水平； 展开缸必须密闭，使展开缸内能被展开剂蒸气饱和且展开剂组成不变，得到理想的分离及重现的结果。 磨口盖要严密，必要时可涂少量凡士林或甘油淀粉糊密封，但须防止污染薄层板及展开剂。,展开缸,薄层展开缸常用方形及园形二种，方形者有不同尺寸及平底或夹心槽
12、（双槽）可供。 圆形上端用钢卡使玻璃盖扣紧密封。 双槽展开缸使用时先将展开剂倒在槽的一侧，将薄层板放入到另一侧，密闭饱和一段时间后再将展开缸倾斜，使展开剂流入放有薄层板的一侧，进行展开。,双槽展开缸,1、先将板斜放入无展开剂的槽内进行饱和 2、饱和1015 min后倾斜展开缸，让板浸入展开剂中展开,圆形展开缸,四种饱和方式：A不饱和；B部分饱和；C有滤纸直接展开法；D充分饱和,A,B,C,D,四、影响展开的因素,1、相对湿度 2、溶剂蒸气 3、温度 4、展开方式 5、展距 6、展开缸的放置,影响展开的因素1：相对湿度,在吸附薄层中，特别是应用亲水性吸附剂，展开的过程中，空气的相对湿度以及展开室
13、中的水蒸汽必须严格控制，因为水蒸汽与吸附剂之间有很大的亲和力，即使是微量的水蒸汽对色谱分离结果也会产生较大影响。展开时最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性。,薄层展开时控制湿度应注意的问题（了解）,记录相对湿度：在色谱条件中除固定相、展开剂等条件外，将认为最佳分离条件时的相对湿度记录下来，为以后工作提供参考。 控制相对湿度 硫酸溶液法 无机盐饱和溶液法,薄层展开时控制湿度应注意的问题,硫酸溶液控制湿度方法表,影响展开的因素2：溶剂蒸气,平面色谱分离过程是在两相未充分平衡的状态下进行的，与柱色谱不同，气相也参与了展开过程，因此薄层的展开过程比较复杂。也因此产生了一些现象如边缘效应、双展开前沿等
14、。常规的平底展开室一般是用展开剂浸湿的滤纸贴在展开室内壁，如果需要可用小烧杯盛与展开剂不同的挥发性酸、碱进行饱和或预平衡。另展开时，应注意展开室的密闭。,影响展开的因素3：温度,展开时环境的温度对纸色谱的影响较大，一方面是由于纸色谱展开时间较长，另一方面因为纸色谱属于分配色谱，组分的分配系数受温度的影响比较明显，因此在进行纸色谱的展开时应注意保持恒定的温度。 温度对薄层色谱的影响较纸色谱小，在吸附色谱上，温度从20度变到4度即不影响展开时间，也不影响比移值，除了特殊要求，薄层色谱可在室温下进行。,影响展开的因素4：展开方式,不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的分离效果有明显的影响。应根据
15、样品的理化性质及分析要求选择合适的展开方式。,影响展开的因素5：展距,一般纸色谱的展距为2030 cm,常规薄层展距未1020 cm，高效薄层展距为510 cm，在这种展距内得不到分离得组分，增加展距并非是解决问题得方法，因为分离度仅正比于展距得平方根，延长展距不仅延长了时间，而且会引起斑点扩散降低分离度。可以通过改变展开方式或优化展开剂，以得到理想的分离结果。,影响展开的因素6：展开室的放置,展开室应放在水平、稳定的实验台上，不能有阳光直射，也不能在通风处放置，离开热源，避免温度波动对分离不利，光敏物质的分离应将展开室置于暗处。,第六节 展开后处理与检视,一、展开后处理 二、斑点检视 1、光
16、学检视 2、蒸气检视 3、试剂显色 4、生物自显影,一、展开后处理,1、到达目标展距，立即取出标记溶剂前沿； 2、立即去除平面上的展开剂，以防定性参数测量错误以及斑点扩散等不良后果。,二、斑点检视1：光学检测,此法使用方便，被检出物质不被破坏，适用 于双向展开，多次展开时的定位，也适用于洗脱 定量时定位。是平面色谱定位的首选方法。 吸收可见光组分可目视检测； 吸收紫外线组分可紫外光检测； 发射荧光组分可进行荧光检测； 吸收紫外线但无紫外光谱特征的组分可利用荧光板形成的暗斑检测。,光学检测,紫外灯检出宜在暗室中进行，365nm常用于组分所固有或与试剂作用后产生的荧光，254nm则可因该组分吸收此
17、波长的光呈现可见斑点。 若样品系用荧光板展开，则组分因其对板上荧光物质的淬灭作用，将在亮的荧光背景上，呈现暗的斑点。,光学检测,365nm,254nm,便携式紫外检测器(UVD),二、斑点检视2：蒸气显色,采用碘蒸气显示薄层板上有机物的斑点有很多优点：简单、快速灵敏、经济，它是非破坏性的，并且易于在板上勾画斑点。,利用一些物质的蒸气与样品作用生成不 同颜色或产生荧光。反应有可逆和不可逆两种，如常用的碘蒸气。,二、斑点检视3：试剂显色,根据被检出化合物的理化性质选择适当的显色剂使之生成颜色或荧光稳定、轮廓清楚、灵敏度高、专属性强的斑点。此法是平面色谱中广泛应用的方法。如氨基酸的显色定位。,气压式
18、喷雾器,二、斑点检视4：生物自显影,具有生物活性的物质，如抗菌素等，在纸或薄层上分离后与有相当的微生物的琼脂培养基表面接触，经在一定温度下培养后，有抗菌活性物质处的微生物生长受到抑制，琼脂表面出现抑菌点而得到定位。 主要用于抗菌素的效价测定、中药才鉴定等,第七节 定性与定量分析 1、定性分析日光，紫外光，显色 2、定量分析洗脱法，薄层扫描法（了解）,1、薄层定性分析,斑点的比移值 斑点的显色特性：在自然光或紫外光下根据斑点的荧光或颜色定性，是中药指纹图谱的重要鉴别方法。 原位光谱扫描：通过各种图谱扫描，可对样品和对照品进行对比定性。 薄层和其它分析技术的联用：如气相色谱、液相色谱、电化学法及各
19、种光谱法等，极大的增加了薄层的定性能力。,定性,每种组分的Rf值在一定条件下为一常数，但由于影响Rf值的因素较多，因此根据一种展开剂展开后得到的Rf值作为定性依据是不够的，需要经过两种以上不同组成性质的展开剂得到的Rf值并与对照标准品比较，相互一致时，才可认定该斑点与对照品是同一种化合物，如果二者的Rf值不同，可以作出不是同一化合物的结论。,第八节 纸色谱法(Paper Chromatography, PC),将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量的液-液分配色谱法,固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：,
20、讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留，Rf 小（流动相极性， Rf ） 非极性组分易流出，Rf大（流动相极性，Rf ）,第九节 平面色谱的特点及应用（了解）,一、平面色谱的特点 二、薄层色谱在中药分析中的应用 三、薄层色谱在合成药物分析中的应用 四、薄层色谱在其他领域中的应用,一、平面色谱法特点1：优点,由于固定相是一次性使用，样品的前处理比较简单 对被分离物质的性质没有限制，应用广泛 平面色谱具有多路柱效应，可同时平行分离多个样品 分离样品所需展开剂量极少，即节约溶剂又减少了污染 固定相，特别是流动相选择范围宽，有利于不同性质化合物的分离 应用不同的展开方式有利于难分离物
21、质对的分离 同一色谱是可根据分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方式进行定性或定量。 唯有薄层色谱技术可提供原始彩色图像，不仅便于保存原始图像并可通过色谱图像分析提供多层面的信息，直观性、可比性极强。,一、平面色谱的特点2：重现性差,层析结果受多种因素影响，如只作定性分离，则对每一步的要求和操作不很严格，如果要作含量测定、杂质检查，则每一步都要十分注意并严格操作，否则达不到定量分析的准确度和精密度。,二、薄层色谱在中药分析中的应用,中药材的鉴别：主要依据薄层色谱上斑点的比移值、颜色及整个色谱的指纹分析。 中草药成分分析：是薄层应用最广的领域，对中草药中各成分的分离分析几乎都能适用。 中成药鉴别
22、及质量标准研究,六味地黄丸阳性对照薄层色谱图,1.牡丹皮 2.熟地黄 3.山茱萸 4.六味地黄丸 5.泽泻 6.山药 7.茯苓 8.蜂蜜,中成药薄层色谱鉴别,六味地黄丸阴性对照色谱图,1.牡丹皮阴性对照液 2.熟地黄阴性对照液 3.山茱萸阴性对照液 4.六味地黄丸 5.泽泻阴性对照液 6.山药阴性对照液 7.茯苓阴性对照液 8.蜂蜜阴性对照液,中成药薄层色谱鉴别,不同厂家六味地黄丸薄层色谱图,1.天津厂 2.济南厂 3.沈阳中药厂 4.模拟药丸 5.北京厂 6.宁夏厂,结论：不同厂家生产的药丸均呈现7个特征斑点,中成药薄层色谱鉴别,三、薄层色谱在合成药物分析中的应用,药物的定性鉴别 药物的纯度
23、检查 合成药物制剂的含量测定 稳定性考察 药物的代谢研究 合成工艺的监控及反应机制的研究,四、薄层色谱在其它领域的应用,生化样品分析：血样、尿样、蛋白质及核酸的分离分析。 毒物分析：中药中有毒成分的分析亦可用薄层色谱法。 手性药物分析,本章要点小结:,1、掌握平面色谱的一般过程及关键技术要求； 2、熟悉平面色谱的分类及分离机理； 3、掌握薄层色谱法的定性参数-比移值的计算； 4、熟悉纸色谱的原理和操作要点,了解该方法的应用领域； 5、了解平面色谱法的特点； 6、了解薄层色谱技术在药物分析中的应用。,本章公式小结：,n=16(L/W)2,H=L0/n,思考题及习题,1、思考题P323 113,16（题中关于薄层扫描的部分不做）。 2、习题P324 1、3、4 。,
