1、 1 HIV 疫苗研究现状疫苗研究现状 获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）即艾 滋病，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染引起的 一种恶性传染病，HIV-1 是引起全球 AIDS 流行的主要病原，在我国境内流行的 HIV 主要包括 M 组的 B 亚型、C 亚型及二者重组的毒株。AIDS 是一种严重危害 人类健康的传染病，轻壮年多发，它具有临床症状各异的复杂性免疫抑制，引起 人体 CD4+ T 细胞数量的进行性减少，细胞免疫功能损害。目前的治疗方法难以 清除细胞内的病毒感染。
2、病毒持续存在于淋巴细胞内导致感染迁延化，并破坏免 疫系统，发生多种继发感染和机会性感染以及导致肿瘤发生和中枢神经病变。因 此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义。 近年来，随着艾滋病毒免疫生物学和免疫病理学的飞速进展，保护性免疫的 概念也发生了深刻变化，研究表明：HLA-类分子介导的细胞免疫，特别是由 抗原特异性 CTL 所介导的细胞毒作用，在控制 HIV 感染的过程中起核心作用， 是清除细胞内感染病毒的关键。有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合与搭 配，基于多表位组合的重组疫苗有望打破宿主对 HIV 抗原的免疫耐受。 天然病毒抗原由于含有一些对保护性应答不利的组
3、分，容易导致机体 Th1/Th2 类免疫反应失去平衡，细胞间信号传递受扰，免疫应答偏差或缺陷。因 此必须在抗原表位水平上对天然抗原分子进行改造或修饰，以去除对免疫应答不 利的因素， 同时保证应答的特异性。 本研究在 HIV 抗原表位丰富数据资料的基础 上，选择 HIV 免疫优势 CTL 表位并辅以通用表位、以及 HIV p24 核心抗原共同 模建，优化成为多表位抗原分子，并拟通过实验免疫研究，希望能构建出诱导 MHC-类分子介导的特异性细胞免疫应答，打破宿主对 HIV 抗原的免疫耐受， 从而防控 HIV 感染并使感染者经接种能改善病程的有效侯选疫苗。 在过去的十几年中， 在猴和人体中进行过多种
4、具有代表性的 HIV 疫苗免疫保 2 护试验， 并对近百种 HIV 候选疫苗的安全性和免疫原性进行了评价， 试验结果表 明，体液免疫和细胞免疫对人体都有保护作用。 单纯病毒蛋白免疫以体液免疫为主，极少引起细胞免疫应答。活载体疫苗在 引起体液免疫的同时，还能诱导机体产生以 CTL 应答为主的细胞免疫反应。常 用来作载体的病毒有痘病毒、杆状病毒和腺病毒等。 适合表达大量 CTL 表位的疫苗包括 DNA 载体疫苗和病毒载体疫苗。 痘病毒 载体是 HIV 疫苗研究的热点。其优势在于：病毒在宿主细胞的胞浆中复制，无致 癌性；插入的外源基因容量大，可发展联合疫苗；可诱导机体同时产生细胞免疫 和体液免疫；疫
5、苗易生产和保存等。对于金丝雀痘病毒、鸡痘病毒等禽类病毒， 其在哺乳动物体内不复制， 因此安全性更高。 已进行的研究表明， 重组痘苗病毒、 金丝雀痘病毒可表达 HIV 蛋白， 免疫后可在动物体内产生抗体和 CTL 免疫应答。 基因疫苗， 也称DNA疫苗或核酸疫苗， 是将一个或多个基因插入到载体DNA 中，再将此 DNA 接种于机体细胞，使相应的基因在肌细胞等细胞内表达抗原， 诱导机体产生细胞和体液免疫应答。该种免疫接种的特点是，表达的抗原蛋白具 有天然构象，抗原递呈与自然感染相似；长期表达外源蛋白；兼具重组亚单位疫 苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体同时产生体液与细胞免疫应答的优点。 近几年出现的以
6、甲病毒为基础的自杀性 DNA 疫苗，已成为提高基因疫苗免 疫效果和安全性的重要策略。这种疫苗不会产生感染性病毒粒子，不会与细胞基 因组发生整合，但能复制和表达外源抗原基因，利于 MHC-类抗原递呈，并诱 导全身免疫应答和粘膜免疫及细胞免疫应答，因此非常安全有效。 综上所述，HIV 侯选疫苗的研究已经从传统疫苗向新型疫苗过渡，在抗原分 子的选择设计方面也不断以新的发现和理论为基础，向优势特异性免疫诱导和抗 原表位设计方面迈进。为此本研究开展了 HIV 多 CTL 表位重组疫苗的设计、构 建及其实验免疫研究。 3 第一章 HIV 疫苗的进展与展望 HIV/AIDS 的广泛流行持续蹂躏着人类社会，只
7、有研发一个安全、有效、廉 价的疫苗或将控制住这一局面，同时在 AIDS 肆虐严重的发展中国家能够轻易实 现防控疾病这一目标。艾滋疫苗研发面临棘手的实践、政治、经济、社会和伦理 问题，而目前最基本的难题在于 HIV-1 感染和致病机理等基础生物学方面能否尽 快取得更加深入的突破与发现。谈到这些生物学问题，三个大的难题隐约可见： 第一个是能否设计出激发中和抗体的免疫原， 并能与广谱的 HIV 原始分离株发生 抗病毒反应；第二是疫苗激发的细胞毒 T 细胞反应能否比 HIV 自然感染出现的 反应在根本上能更好的控制 HIV-1 的复制并改善病程；第三是疫苗激发的保护性 免疫反应的广度在多大程度上能与全
8、球 HIV-1 丰富的基因型相适应，并且 AIDS 疫苗的整体有效性为多少？虽然这是三个特别具有挑战性的问题，但是它们正在 被逐渐解决，在明确理论假设的前提下，随着疫苗设计技术和免疫学方面的一系 列进步，相关试验也在顺利开展。AIDS 疫苗研究领域在多大程度上可以团结一 致，相互协调，共同面对上述难题，并采取最有效的措施或许是有效 AIDS 疫苗 如何和何时面市的重要决定因素。 HIV 被发现并显示会导致 AIDS 已经是 20 年前的事了，但时至今日仍无安 全有效的疫苗来防止感染或改善疾病。结果，HIV/AIDS 流行造成的负担以及人 类由此遭受的苦难触目惊心且还在持续加重。 全世界有超过
9、4,500 万的 HIV 感染 者，包括过去一年内 400600 万的新增感染者。尽管有高效抗逆转录病毒疗法， 有助于抑制疾病进展（在能获得并负担得起的地方） ，全球死于 HIV/AIDS 的人 数还是在去年达到惊人的 250350 万人1。因为大多数新出现的 HIV 感染者都 在发展中国家，缺乏经济力量和相应的机构来获得并开展有效的抗病毒治疗，所 以急需研制安全、有效、易接种、廉价的 AIDS 疫苗。 4 多方面的证据显示，AIDS 疫苗的研究现在正处于关键点上。在 20022004 年的 18 个月里，两个进入期临床的 AIDS 疫苗实验结果被披露2 、3。虽然这些 研究被成功开展，但是结
10、果显示重组 HIV-1 外膜 gp120 单体疫苗没有保护效果。 考虑到其困难，即通过接种激发出能中和 HIV-1 原始分离病毒的抗体的难题尚未 解决，这些失败的结果已经被研究领域内许多研究者所预料到（即 AIDSVAX 没 有激发中和 HIV-1 原始分离病毒的抗体） 。伴随上述研究结果，应用传统的，经 验的方法开发 AIDS 疫苗的呼声日见衰微， 而通过对 HIV 生物学和病理学作基本 洞察并在明确理论假说框架内以发展的理念和途径研发疫苗的呼声则更加高涨。 在此基础上的疫苗研究，面临着三大难题，除非找到合理的解决方法，否则将妨 碍安全有效 AIDS 疫苗的研制。 此篇综述注目于最近 AID
11、S 疫苗研制方面的概念要点，分析当前的研究状况 图 1-1 WHO 官方网站关于 HIV 感染率的统计图示 Fig. 1-1 WHO website photograph about HIV infected adult people 5 以便明确这些问题为何产生。 通过评述， 试图解释 HIV 的外膜蛋白为什么很难被 抗体中和，以及为什么配置的外膜抗原如此的难以激发有效的高滴度的中和抗 体，相比之下天然的病毒外膜糖蛋白经科学观察表明却十分有效4。而且，从实 际观察来看，设计出能激发针对原始分离株的中和抗体的外膜蛋白免疫原，其路 途尚远。当前，相比于解决所谓的抗体问题，AIDS 疫苗领域关注的
12、焦点大部分 在 CTL 细胞免疫方面5 、6。本质上， 疫苗接种在非感染者身上诱发的抗 HIV CTL 免疫反应并不一定能产生保护效果，但可以使接种者在感染后能够更好的控制病 毒的复制，从而使得 AIDS 的进展变缓或不进展7。此外，考虑到感染者体内病 毒复制的总体水平（病毒载量）明显与其传染给他人的风险相关8，疫苗注射在 减低病毒载量的同时就降低了二次传染几率，因此使得 AIDS 的流行传播速度减 慢。CTL 的可靠性目前还不确定，但是以激发 HIV 特异性 CTL 反应为目的的新 型疫苗的设计已经开展，为了达到足够的反应强度，可以直接通过精心设计的临 床实验来评价 CTL 疫苗9，这可能是
13、目前艾滋疫苗研究最为紧迫的任务，有望在 近期取得进展。 虽然 HIV 基因的多样性是艾滋疫苗研究面临的最棘手的生物学问 题，但是也应注意到，一旦能抵抗相近基因型毒株的疫苗出现，基因多样性产生 影响的强度和意义都将降至最低。因此，当 HIV-1 的多样性还是一个格外重要的 问题时，可能是因为我们还需要一些时间，在有效疫苗出现前，充分认识它的实 际意义并找到解决这一困难的方法。 1 AIDS 疫苗研究面临的问题 大量事实已经证明，HIV 自然感染不能导致保护性免疫的产生。而且，HIV 往往在感染者体内建立起持续性的终身感染，最后绝大部分感染者在不进行抗病 毒治疗的情况下都出现致死性的感染（约为 9
14、8%）10。需要着重指出的是，在 HIV-1 感染者身上看不到宿主免疫系统清除感染病毒以及针对反复感染产生免疫 应答的迹象。结果，保护性免疫相关的潜在因素一直无从知晓，使得人们也一直 没有通过接种来激发保护性免疫可以效法的确定模式。 除了最近的水痘-带状疱疹 减毒活疫苗，可以改善水痘原发感染伴随的典型自限症状，还没有其它疫苗可以 6 成功地抵抗在宿主反复建立终身感染的病原。 此外， HIV 以及 HIV 感染生物学方 面几个关键的特征，都对有效疫苗的研发提出了新的，目前还没有克服的困难和 挑战11。这些生物学特征包括：病毒粒子很难被抗体中和；HIV 选择性感染、渐 进性破坏 CD4+ T 辅助
15、细胞，并损害其再生功能；病毒在体内快速进化，由此产 生对细胞免疫和体液免疫抗病毒反应的逃避；还有就是病毒极其丰富的基因型伴 随着不同（且持续变化）的地域分布与流行特点。此外，HIV 逃避免疫监视，并 且抵抗宿主清除病毒感染，这种抵抗通过其他一些机制，包括 HIV Nef 蛋白下调 受感染细胞表面 MHC-分子水平，以及前病毒在长寿 CD4+ T 淋巴细胞中建立 潜伏感染，从而造成持续性的、免疫盲视的、病毒贮主式感染。 2 HIV 外膜糖蛋白的免疫原性与疫苗研究 HIV 外膜糖蛋白复杂的结构天生抵抗抗体的攻击， 并且它快速变异逃避感染 个体产生的任何中和反应的能力是病毒成功逃脱宿主抗病毒免疫反应
16、的主要原 因。 上述特征在当前的疫苗全都不能激发有效中和抗体反应抗 HIV 方面也是主要 的因素。HIV 外膜蛋白以 gp120 与 gp41 亚单位非共价异二聚体形成同型三聚体 形式存在于病毒粒子和产毒的感染细胞表面3。高度可变的环型结构散在于更保 守的、 功能型限制性区域， 从而在物理上屏蔽了中和抗体识别的外膜关键表位 （即 与 CCR5 趋化因子辅助受体相互作用的区域） 。 此外， gp120 亚单位上的关键表位 也被高度糖基化和 gp120 寡聚化闭合的方式与抗体屏蔽起来12。实际上，比一般 抗体结合位点略大的 gp120 保守性辅助受体结合位点的暴露，依赖于 gp120 与 CD4
17、分子结合以后 gp120 的构象改变。然而，随着 CD4 诱导表位覆盖在辅助受 体结合区域，又带来不利的强烈限制（在无 CD4 时） ，并妨碍抗体与 gp120 此一 保守区的结合。这种构象掩蔽是 HIV 逃避抗体介导的中和反应的另一个机制。 除了 HIV 外膜糖蛋白复杂的结构特征以外，在 HIV 自然感染过程中，有效 的中和抗体反应的激发显然都针对感染的 HIV 毒株 （即并非广泛性的中和抗体） 。 然而，免疫系统产生有意义抗病毒反应的能力在长期会受到它们对病毒快速选择 产生的突变的限制（中和抵抗） ，外膜蛋白的突变是中和抵抗病毒群成功取代始 7 发感染中和敏感病毒群的结果，因为病毒总是比免
18、疫系统的变化领先一步13。最 近， 对于不同同性恋人群的 HIV 传播研究表明， 病毒外膜蛋白编码较短可变环 （这 可能使构象开放和中和敏感）的毒株或许更利于传播，和/或更适合在非 HIV 携 带人群体内复制。如果这种传播特征在其他人群中也普遍存在的话，可以认为此 为 HIV 感染过程中重要的基因限制性瓶颈，并且也是疫苗研发重要的关键点14。 事实上，如果上述毒株特点代表了传播的普遍特征，通过接种激发抗体中和传播 的病毒和/或早期出现的 HIV-1 毒株可能更为容易， 而不象在高抵抗性 HIV-1 毒株 致慢性感染人群中观察到的结论那样。 虽然典型的中和抗体反应在感染个体仅仅短时有效（并且与其
19、他分离毒株无 广泛交叉反应） 13，仍然有几株单抗（B 细胞来源或通过在自然感染 HIV 感染者 的免疫球蛋白基因中经分子克隆获得） 被分离制备并显示了对一系列 HIV 原始分 离株、除实验室连续传代株（HIV T 细胞系适应株）的有效中和活性。这些单抗 经详细的特性分析发现，它们有效的靶向 gp120 和 gp41 亚单位的保守区域。对 其中两株单抗（b12、2G12）的分子结构分析表明靶向 gp120 的单抗具有非同寻 常的分子结构，能够穿透 gp120 的分子甲胄。以 b12 单抗为例，其延长的指状抗 原结合域使得抗体能结合通常凹陷的 CD4 结合位点的表位，从而阻止 CD4 与 gp1
20、20 的黏附。相应的，单抗 2G12 通过 Fab 域上独特的交错结构与 gp120 上密 集的糖基部分结合，在新的结构上解决了识别这些糖基残基的难题。除了抗体不 一般的分子结构特点以外， CD4 诱导型抗体特别的翻译后修饰也保证了其具备中 和 HIV 的能力。这些非同寻常的修饰特征包括一些 CD4 诱导型中和抗体抗原结 合结构域的酪氨酸残基磺基化，似乎模拟了 CCR5 辅助受体上的酪氨酸残基磺基 化，而其在 CCR5 与 gp120 的结合中起着关键的作用15。除靶向 gp120 与受体相 互作用的单抗之外，已经确认有几株具广泛中和活性的单抗（4E10，2F5）靶向 gp41 相对保守的区域
21、，从而阻断病毒与细胞的融合过程。当然，针对 gp41 的中 和抗体的应用仍然需要克服在融合过程中抗体结合表位空间和动力学上暂时暴 露所带来的限制和难题。 8 因为对 HIV 原始分离株显示广泛中和作用的单抗可以以重组蛋白的形式大 量生产并在动物模型中进行实验，以上单抗的联合被动免疫接种（局部的或系统 的）预防 HIV 感染的评价正在进行。在 AIDS 非人灵长类模型中，上述中和单抗 的系统性被动免疫接种（在体内获得高抗体滴度的条件下）能够在 SHIV 攻毒时 保护恒河猴免受感染16。然而，如果在实际中全部应用免疫球蛋白系统性被动接 种抗 HIV 感染时，尤其在最需要有效 AIDS 疫苗的发展中
22、国家人群，可能会受到 经费等方面的限制。在其他被动免疫接种研究中，阴道黏膜局部接种单抗 b12 能 够保护恒河猴在 SHIV 阴道内攻毒时免受感染17。努力开发基于抗体的局部抗病 毒制剂仍然十分有前景，它提供了一种在短时间保护个体免受 HIV 感染的方法， 这将在限制尤其是高危人群 HIV 经性途径传播方面起到实际作用。虽然前景不 错，但是在人体应用这些方法可能会受到制造成本过高的限制，牵涉到剂量问题 及每剂量需多少抗体才足以获得保护。 考虑到应用单抗被动预防 HIV 在实际中的限制， 面临解决针对这些所谓的复 杂抗原带来的主要问题就是设计相应的能够在体内激发同样广泛中和反应活性 的抗原。鉴定
23、发现广泛中和反应活性的单抗与天然 gp120 三聚体通常有高的亲和 力，说明它们是由病毒粒子表面具天然构象的 gp120 诱导产生的，而并非来源于 单体的刺激，这也可以解释为什么 gp120 单体作为免疫原很难诱导产生中和反应 抗体18。不幸的是，世界上两个进入期临床实验的 AIDS 疫苗抗 HIV 感染有效 性评价中，gp120 单体疫苗（AIDSVAX B/B,AIDSVAX B/E, VaxGen）激发的抗体 反应完全没有保护效果。 虽然这种 gp120 单体抗原激发的抗体可以中和 T 细胞系 适应的 HIV 分离株， 但是不能诱导产生抗 HIV 原始分离株广泛反应活性的抗体。 在 75
24、00 多人进行接种的失败的 gp120 单体疫苗（AIDSVAX B/B,AIDSVAX B/E, VaxGen）激发的抗体保护性研究中，疫苗研究人员目前正在探索计算在 HIV 外 膜亚单位产生的有关的分子结构信息资源，构建显示开放构象的免疫原，目标是 产生中和抗体3。设计产生开放构象的外膜免疫原，其实质上可能比天然的外膜 蛋白利于激发中和抗体反应，包括表达更忠实模拟天然三聚体的外膜蛋白（而不 9 是单体） ，表达 gp41 保守的融合诱导结构区，对 gp120 进行分子改造（即缺失可 变区，突变糖基化位点）来暴露中和抗体表位，以及表达保守的只在自然感染中 短暂出现的外膜受体聚合蛋白。 3 细
25、胞免疫的诱导与 AIDS 疫苗研究 由于能激发有效中和抗体反应的相关免疫原的资料缺乏，疫苗策略转而瞄向 激发 CD8+ T 细胞抗病毒反应来控制 HIV 感染者体内的病毒复制水平。 HIV 特异 性 CD8+ T 细胞的抗病毒效果可以从以下几个方面发挥： 诱导凋亡使靶细胞溶解， 分泌细胞因子（IFN-，TNF-）诱导感染细胞处于抗病毒状态，或者通过分泌 趋化因子（MIP 1，MIP 1，RANTES）来阻断 HIV 进入细胞所需的辅助受体 分子（CCR5，CXCR4） ，这样就阻止了其对靶细胞随后的感染19。当然，因为 病毒特异性 CD8+ T 细胞在 CD4+ 细胞感染以后才将其识别为靶细胞
26、，所以不必 担心基于 CD8+ T 细胞的疫苗为了阻止持续性感染会杀死所有的免疫细胞20。基 于 CD8+ T 细胞的 AIDS 疫苗发挥效力的原理在于，降低感染者体内病毒载量水 平，进而有希望减缓其进展到 AIDS 的几率并同时减少其传播 HIV 的可能，这样 就降低了 AIDS 的流行率。 这一理论可以从感染个体 HIV 复制载量水平准确预测 其进展到 AIDS 几率的观察中得到佐证，并且，在感染人群中，高 HIV 病毒载量 与经性传播的高危险性相关21。 从 HIV 感染人群和 SIV 感染恒河猴的研究中得到的其它证据也表明，CD8+ T 细胞介导的免疫反应至少在短时对 CD4+ T 细
27、胞噬性的慢病毒有持续有效的杀 病毒反应，从而支持基于 CD8+ T 细胞的抗 AIDS 疫苗的研发。在 HIV 感染者， HLA-基因对进展到 AIDS 的几率的断定上十分重要， 因为 MHC-组分的多样 性（即个体 HLA 等位基因杂合对纯合的程度）与 AIDS 进展的延迟相关。此外， 特殊的 HLA 等位基因与疾病进展的快（即 HLA-B*35）慢（即 HLA-B*57, -B*27） 有关22。 上述结果产生的确切机制目前还不清楚， 但推测可能与提呈给和被 CD8+ T 细胞识别的 HIV 表位的多样性及特异性有关。在 HIV 感染人群和 SIV 感染恒 河猴中都显示，CD8+ T 细胞
28、介导的抗病毒免疫包括病毒特异性 CD8+ T 细胞出 10 现后病毒血症短时下降； CTL 逃避毒株的免疫压力筛选， 以及观察到在 SIV 急慢 性感染的恒河猴中人工（抗体介导）诱使 CD8+ T 细胞凋亡可致 SIV 病毒血症水 平迅速升高23。此外，在恒河猴动物模型的疫苗有效性实验中显示，接种诱生的 病毒特异性CD8+ T细胞水平与随后SHIV89.6P攻毒病毒复制的杀伤/控制水平相 关，揭示了疫苗激发的 CD8+ T 细胞反应在抗病毒方面的重要作用24。 虽然在 HIV 感染人群和 SIV 感染恒河猴中始终都可以检测到慢病毒特异性 的 CD8+ CTL，但是这些免疫反应最终都不能在自然感
29、染（非治疗）情况下控制 病毒的复制。究竟 CD8+ T 细胞在控制病毒复制中是否发挥重要作用，还应在感 染者中观察 HIV 特异性 CD8+ T 细胞水平与病毒载量的负相关关系。然而，虽然 在慢性感染的一项早期研究中观察到病毒载量与HIV特异性CD8+ T细胞水平的 负相关，但这一发现在其它研究中却没再见到25。最近，两项综合性、系统性衡 量 HIV 特异性 CD8+ T 细胞反应（评价抗原特异性 IFN-产生）的大的实验中， 不能确定 HIV 特异性 CD8+ T 细胞水平（广度和反应）与 HIV 病毒载量有任何 相关25 、26。上述结果可以部分的解释为体外评价细胞因子产生方法（ELIsp
30、ot， 胞内细胞因子染色） 的限制， 这些手段目前普遍应用于 HIV 特异性细胞免疫反应 的评价， 能够精确鉴定 HIV 特异性的在体内呈现抗病毒活性的细胞。 考虑到以上 特点，识别 HIV 抗原后细胞的增殖扩增能力，以及感染者 HIV 特异性 CD8+ T 细胞穿孔素表达水平都被衡量 IFN-的产生所代表， IFN-的产生较好的反映了 体内免疫细胞的抗病毒功能27，并与体内低 HIV 病毒载量相关。这种 HIV 病毒 载量与体外衡量细胞 IFN-产生关联的缺乏提示，并非所有 HIV 抗原激发后检 测到的 HIV 特异性 CD8+ T 细胞都在体内具有抗病毒功能。 这一解释有助于说明 （同 C
31、TL 逃避中相对适用度和不同的病毒突变一起）为什么具有某一表位的毒 株能被感染个体 HIV 特异性 CTLs 所筛选出来， 而含其他表位的毒株在体内没什 么改变，尽管存在持续性的、体外可检测到的表位特异性免疫反应28。 HIV 特异性 CD8+ T 细胞在感染早期发挥作用， 但是最终却不能控制 HIV 的 复制的可能原因包括：HIV 具有产生 CTL 逃避株的惊人能力，在免疫优势 CTL 11 表位出现特殊的变异，就如同抗原提呈中侧腹 CTL 表位区29；HIV 基因产物导 致的免疫逃避机制包括Nef介导的HLA I类分子的表达下调， 以及可能由HIV Rev 蛋白介导的 HIV 感染细胞对
32、CTL 杀伤敏感性的变化；HIV 渐进性破坏并损害 CD4+ T 辅助细胞的再生功能，导致缺少足够的 CD4+ T 辅助细胞来维持 CD8+ T 细胞的功能；还包括 HIV 特异性 CTL 在成熟、分化过程中出现缺陷30。在上述 这些原因当中，最重要的是保存 HIV 特异性 CD4+ T 细胞的功能对保证 CD8+ T 细胞正常分化，并发挥控制 HIV 复制的作用，在急性和慢性感染中，CD4+ T 细 胞都具有维持 HIV 特异性 CD8+ T 细胞抗病毒功能的作用（在体内） ，这可以在 SIV 和小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的慢病毒感染模型中，病毒特 异性CD8+ T细胞抗病毒功
33、能发挥与CD4+ T细胞所起的关键作用上得到验证31。 比较典型的 HIV 感染个体进展到 AIDS 时， 所出现的强的但最终无效的抗病 毒 CD8+ T 细胞反应，仍然显示抗病毒 CD8+ T 细胞反应在长期不进展者中起到 了控制 HIV 复制的作用，个别 HIV 感染者在不进行抗病毒治疗的情况下，血浆 病毒载量很低或检测不到。而与此相反的是，在 80 名不进展者中得到的数据表 明，HIV 特异性 CD8+ T 细胞反应的广度和强度（通过 IFN-细胞因子检测）在 统计学上与不治疗 HIV 进展者的观察数据无区别。 并且， 不进展者中较好的个体， 病毒载量很低的，其 HIV 特异性 T 细胞
34、水平也是最低。这些观察表明，体外通 过 IFN-分析检测的 HIV 特异性 CD8+ T 细胞反应水平都是体内 HIV 抗原激发 的，而不是抗病毒效应的水平，所以才会出现 T 细胞反应与 HIV 病毒载量相矛 盾的结果32。需要指出的是，不进展者的免疫学分析（HIV 特异性 CD8+ T 细胞 体外增殖/穿孔素表达分析）表明，与典型的 HIV 病程相比，这些特异性 CD8+ T 细胞反应在不进展者体内长期存在。总之，可望应用最好的分析方法描绘和定量 的主要细胞免疫功能参数来主导病毒载量的变化及病程进展， 目前在不同的 HIV 感染人群仍是不确定的。转而，在长期不进展者中观察到的特别的低病毒载量
35、应 该考虑其生物学因素（即对损伤性病毒的适应性） ，而不是传统意义上的免疫遏 制的概念。 12 一些有影响的数据支持着“基于 CTL”的 HIV 疫苗的研发，包括在一些高 度暴露却不感染 HIV 的个体，可以检出（虽然水平较低）HIV 特异性 CD8+ T 细 胞应答33，预示这些细胞免疫反应可能与抵抗感染有关。在内罗毕一些连续暴露 的抗 HIV 性从业人员中，当高危险暴露的频率锐减时，HIV 感染率上升34。由 此，CD8+ T 细胞介导的保护（如果真的和明显锐减导致易感有关）与传统的激 发并维持 CD8+ T 细胞免疫记忆来实现的概念不符。并且，类似的 HIV 特异性 CD8+ T 细胞应
36、答在其他 HIV 暴露人群及持续血清阳性个体中观察不到35。 总之， 高暴露不感染个体检出低水平抗 HIV CD8+ T 细胞应答在当前并非是一般性的观 察结果，而对此种免疫应答起到保护作用的推断是十分确定的。 因为自然激发的 HIV 特异性 CD8+ T 细胞反应一般不能最终抑制病毒的复 制，所以基于 CD8+ T 细胞的 AIDS 疫苗即使不能诱导更强大的细胞免疫应答， 也要诱导比 HIV 自然感染更好的细胞免疫应答。根据这一考虑，明确候选 AIDS 疫苗激发的 HIV （或 SIV） 特异性 CD8+ T 细胞反应的特征， 以及这些特征与 HIV 或 SIV 感染产生的免疫特征为什么不同
37、是有助于真正有效 AIDS 疫苗研发的重要 因素。 如果自然激发的 HIV 特异性 CTLs 总是不能控制病毒的复制， 为什么我们要 希望疫苗诱导的 CTLs 会更有效并且能提供足够水平的抗病毒保护呢?有两个主 要的原因使我们如此乐观。第一，AIDS 疫苗可以促使产生比自然感染激发的更 有效的 HIV 特异性 CTLs，因为疫苗能够先于感染激发有利的 CD4+ T 细胞介导 的辅助反应，并在感染后更好的呈现这种抗病毒反应。在 SIV 感染的恒河猴，最 大限度激发CD8+ T 细胞和抗体应答以及维持CD8+ T细胞的功能都需要CD4+ T 细胞的存在31。在 HIV 感染者，伴随感染，很早就出现
38、 HIV 特异性 CD4+ T 细 胞缺失，因为它们优先被病毒感染（并被杀死）36，从而使适当的 T 细胞辅助功 能缺失， 而它们在 HIV 特异性 CTLs 的产生与/或足够数量全功能 CTLs 的维持方 面都需要。急性 HIV 感染的联合抗病毒治疗增强 HIV 特异性 CD4+ T 辅助细胞 应答，而结构性治疗阻断（在急性 HIV 感染病人或 SIV 感染的恒河猴）激发的 13 HIV 特异性细胞免疫应答则是通过被控制的再次暴露的自体病毒抗原的刺激，随 着治疗的停止， 可能导致随后控制病毒复制的能力受限37。 为了达到效果， AIDS 疫苗需要激发比 HIV 感染者通过结构性治疗阻断增强的
39、持久力有限的、 以及对目 前 HIV 感染只提供微弱控制并对 HIV 超感染几乎无保护的应答更加有力的免疫 反应38。基于这种预期，AIDS 疫苗必须能产生抗 HIV 的更好的细胞免疫应答， 在没有 HIV 复制并感染及杀死 CD4+ T 细胞的时候就激发基本的、 HIV 特异性的 细胞免疫反应。 从而， AIDS 疫苗的基本免疫将有望来自一群正常、 全功能的 HIV 特异性 CD4+ T 辅助细胞，并产生和维持正常数量的有效的抗病毒 CD8+ T 细胞 39。 因为保存 HIV 特异性 CD4+ T 细胞反应可能对于在急性和慢性感染中通过维 持 HIV 特异性 CD8+ T 细胞的增殖能力和
40、杀伤功能有效控制 HIV 复制非常关键， 所以 AIDS 疫苗或许能通过提供足够的 HIV 特异性 CD4+ T 辅助细胞，有效的使 免疫系统在与病毒的赛跑中获得领先。 第二个值得乐观的原因和最近对于 T 记忆细胞分化成熟的调节过程被阐明 有关40，这对于能诱导大量 CD4+ 和 CD8+谱系的长寿的、保护性的 T 记忆细胞 的 AIDS 疫苗的设计至关重要。基于以上考虑，在小鼠模型上进行的一系列精巧 的淋巴细胞性脉络膜丛脑膜炎病毒感染实验表明，接触抗原的 CD8+幼稚 T 细胞 首先分化为短寿的、快速增殖的效应细胞（TE） ，表达一些激活标记（即，CD25， CD44） ，下调淋巴小体归巢受
41、体（即，CD62L，CCR7） ，并呈现强的即时效应功 能（即产生 IFN-，出现 CTL 活性） 。几周之内，一小群上述 CD8+ TE 细胞进 一步分化为长寿的、增殖缓慢的 T 记忆细胞（TM，通常称为中枢记忆 T 细胞） ， 重新表达 CD62L，CCR7 并表达 CD127（IL7R，为 TM 细胞的特征性标志） 。 这些记忆细胞的即时效应功能有限，但当抗原再次刺激时具有高度增殖潜力。小 鼠的过继转移实验表明， 病毒特异性 CD8+ TM 细胞比 CD8+ TE 细胞在介导攻毒 保护时更有效41。并且，上述模型表明相较连续（LCMV）抗原暴露，间歇暴露 在获得病毒特异性 CD8+ T
42、记忆细胞的完全分化上是必要的。 通过 HIV 感染的动 力学和复制模拟， 足够水平 HIV 特异性 CD8+ T 中枢记忆细胞的产生受制于病毒 14 诱导的 HIV 特异性 CD4+ T 细胞小体的损害和 HIV 慢性感染所致的过量抗原刺 激，所以，HIV 自然感染并不利于 HIV 特异性 CD8+ T 中枢记忆细胞的产生。因 为 HIV 疫苗促进而不是破坏病毒特异性 CD4+ T 细胞反应，并且 HIV 抗原的表 达在免疫个体只是暂时的，所以，通过 HIV 疫苗的预防接种将有望产生 HIV 特 异性CD8+ T中枢记忆细胞。 人们希望在HIV初始感染时疫苗诱导的一群有效的、 分化完全的 CD
43、8+ T 中枢记忆细胞能够限制住始发感染病毒的复制和造成的损 伤，从而使得功能性 CD8+ T 细胞水平增加，在慢性感染中具有更强的控制 HIV 复制的能力。虽然上述 CD8+ T 记忆细胞的分化模型在人类中（以及非人灵长类 中）仍有待被再次证实，但是在鼠/LCMV 系统的研究结果中，对于确认特殊免 疫表型和功能特征的保护性 T 记忆细胞亚群已经提供了重要的实验方向，检测 T 记忆细胞将成为基于 CTL 的 AIDS 疫苗的临床有效性评价的关键指标。 并且， 对 于疫苗和 HIV 感染诱导的抗病毒 T 细胞反应做性质上的区分，现在能通过最近 研发的 CTL 疫苗（更具免疫原性）进行免疫表型和功
44、能的对比说明9。 4 HIV 毒株多样性与 AIDS 疫苗研发 HIV 在感染宿主体内快速的演化得益于其能够逃避宿主的抗病毒反应， 这也 是研发无论是基于诱导细胞或是体液免疫的有效 AIDS 疫苗一直面临的棘手的挑 战。 HIV 高度变异的产生也是来源于在非治疗 HIV 感染中常见的病毒高水平复制 /周转中出现的 HIV 反转录酶的高错配率。据估计，在慢性感染中，HIV 毒株基 因组的每个核酸都有机会发生变异，而一天中可能出现几千次。此外，高几率的 基因重组使得大多数适宜的突变混合匹配，从而逃避宿主的体液和细胞免疫反 应，病毒对宿主最低程度的适应也从个体的逃避突变中产生42。突变、重组所致 H
45、IV 多样性产生的机制依赖于病毒进行着的活跃复制，产生的大量突变病毒在宿 主免疫应答的选择下出现抵抗株。 因此，基于 CD8+ T 细胞的 AIDS 疫苗要想有效，将需要显著的抑制 HIV 的 复制（从感染的最早期开始） ，达到限制免疫逃避毒株产生的目的。类似于成功 的抗病毒治疗，一个基于 CTL 的有效的 AIDS 疫苗需要激发针对 HIV 多个靶点 15 （表位）的反应，包括针对高度遗传保守（即需要多点变异的）和具有高度适应 性变异的病毒表位28。对比于抗病毒治疗，基于 CTL 的疫苗的保护效力将随着 宿主免疫功能遗传背景的不同而不同，因为个体的 HLA 基因型将最终决定哪一 个（及多少）
46、HIV 表位递呈给 T 细胞。 考虑到世界范围内庞大的 HIV 毒株多样性， 设计并选择候选 AIDS 疫苗的抗 原分子是一个令人生畏的挑战。 针对 HIV 感染复制早期通过疫苗接种激发免疫应 答的目标，将需要依次识别 HIV 原始感染和当前循环毒株的表位，种系发生的 HIV 亚型的多样性构成了 HIV 毒株群，其氨基酸水平上基因产物的偏差在 15% （Gag）30%（Env）之间。相比之下，流感病毒的疫苗毒株与循环毒株氨基酸 水平的差距在疫苗允许范围内需要小于 2%。比较冷静的看法认为，全球流感病 毒的多样性在任一年的变化只大致相当于单个 HIV 感染个体一次病毒复制产生 的多样变化。因为种
47、系发生的 HIV 亚型的多样性在不同的地理区域流行，应用 HIV 亚型共有序列作为疫苗抗原已经被提出， 并且在理论上是无可非议的和可行 的方法，期望能够在 AIDS 候选疫苗抗相应病原上消除多样性带来的问题43。 除了抗原设计方面需要克服目前认识到的 HIV 亚型多样性的难题， 循环重组 毒株HIV 流行毒株带来的亚型内嵌合基因组问题， 进一步增加了全球 HIV 的复 杂性，也恶化了相应疫苗抗原的设计难度18。并且，考虑到最近报道的有关 HIV 重组多样性的频率可能具有的数量级比预期要高得多42，面对 HIV 多样性的复 杂局面，有效疫苗的设计仍然任重道远。此外，有证据显示，循环 HIV 毒株
48、的基 因个性在 HLA 限制反应的免疫压力下还是持续在总群水平上进化44。 有人提出， 突变最终导致某一表位不能被宿主的 CD8+ T 细胞识别， 因其失去与 MHC分子 结合的能力，或者结合于 MHC分子的表位递呈时不能被 T 细胞受体识别，亦 或干扰抗原处理过程，将由于 HIV 感染者都具有常见 HLA 等位基因而使得流行 加剧。 如上所述的话， 在某一人群中流行主导的 HIV 病毒将进化的越来越被 HLA 限制的 CTL 反应视而不见，如此，则使 HIV 疫苗抗原的选择过程比现在预期的 要更加复杂43。然而，随着 HIV 在人群中传播并被筛选，这种 CTL 逃避株仍然 16 会持续出现并
49、占据优势28。这种 HIV 全球范围内的进化需要定期的进行重新评 估，以决定 AIDS 疫苗的抗原成分在当时的最佳组成，但通过病毒复制适应性与 结构/功能限制的统一最终这种进化可能达到平衡45。 5 AIDS 疫苗的临床实验研究 截止 2006 年底，全球正在进行的 AIDS 候选疫苗的临床实验超过 170 项46。 而其中的大多数都是小范围的期临床实验， 借以评价不同的 HIV 抗原和载体系 统（大多是预期激发 HIV 特异性 CTLs）疫苗的安全性并获得初步的免疫数据， 这其中引人注目的包括最近启动的一项期临床有效性实验47。20022004 年 世界上首次进行的两个 AIDS 疫苗（只激发抗体的 gp120 单体免疫原疫苗）的 期临床有效性实验都报道了令人失望的结果。其中的一个是 VaxGens 的 AIDSVAX B/B 疫苗北美地区的实验（VAX004） ，二价 gp120 单体（B 亚型）重 组蛋白接种显示在 5,009 名受试者中对降低 HIV 感染率没有效果， 包括男同性恋 人群、
