1、三三 谷氨酸生产菌及扩大培养谷氨酸生产菌及扩大培养教学内教学内容1，了解谷氨氨酸生产产菌的主要特征、特点。2，掌握菌种种的扩扩大培养养方法。3，了解影响响生产产菌生长长的主要因素。教学教学目的与与要求学时：4作业业安排小论论文前言：一，谷氨氨酸菌种种的选选育进进展：1，应应用常规规育种种技术术及其所选选育的谷氨氨酸高产产新菌种种 前言：2，谷氨氨酸生产产菌抗噬菌株的选选育前言：3，采用遗传遗传工程新技术选术选育谷氨氨酸优优良菌种种 前言：二，谷氨氨酸生产产菌保存方法 1，几种种斜面培 养养基 保存方法前言：二，谷氨氨酸生产产菌保存方法 2磷酸盐缓盐缓冲液保存方法的改进进前言：二，谷氨氨酸生产产
2、菌保存方法 3试试管熔封法保存谷氨氨酸菌种种的研研究 前言：二，谷氨氨酸生产产菌保存方法 4液氮氮超低 温温保 存谷氨氨酸菌种种 第一节第一节 谷氨酸生产菌的主要特征和菌学性质谷氨酸生产菌的主要特征和菌学性质一，现有谷氨酸生产菌的分类：一，现有谷氨酸生产菌的分类：现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。这四个属在细菌的分类系统中彼此比较接近。短杆菌属隶属于短杆菌科(Brevibacteriaceace)，而棒状杆菌属、小杆菌属及节杆菌属则都隶属于棒状杆菌科(corynebacteriaceae)。短杆菌科和棒状杆菌科均属于真细菌目中的革兰氏染色阳性、无芽抱杆菌及
3、有芽抱杆菌的一大类。二，现有谷氨酸生产菌的菌学性质：三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：三、现有谷氨酸生产菌的主要特征三、现有谷氨酸生产菌的主要特征（总结）（总结）第二节第二节 谷氨酸生产菌在发酵过谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化程中的形态变化 人们发现，谷氨酸生产菌在发酵过程中会发生明显人们发现，谷氨酸生产菌在发酵过程中会发生明显的菌体形态的变化。实践证明，在发酵过程中发现的菌体形态的变化。实践证明，在发酵过程中发现菌体形态有明显的变化时，正是产谷氨酸的激增时菌体形态有明显的变化时，正是产谷氨酸的激
4、增时间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、不菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、不产谷氨酸的异常发酵。产谷氨酸的异常发酵。一、种子的菌体形态一、种子的菌体形态 斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，
5、无分枝；细胞排列呈单个、成对及分枝；细胞排列呈单个、成对及“V”字形，有栅状字形，有栅状或不规则聚块；分裂的细胞大小为或不规则聚块；分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足，繁殖的菌体细胞均为谷。由于生物素充足，繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。氨酸非积累型细胞。二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态。三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态形态 发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少发酵前期感染噬菌体后，菌体细
6、胞明显减少,细胞不规则，发圆、发胖，缺乏细胞不规则，发圆、发胖，缺乏“”字形排列，字形排列，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞,类类似蛛网或鱼翅状。似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片多毛刺状的东西，有细胞碎片。第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种1，日常菌种工作 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生
7、产菌的育种育种思路 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种育种思路育种思路1.1.切断或减弱支路代谢切断或减弱支路代谢 2 2.解除自身的反馈抑制解除自身的反馈抑制 3.3.增加前体物的合成增加前体物的合成 4.4.提高细胞膜的渗透性提高细胞膜的渗透性 5.5.强化能量代谢强化能量代谢6.6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种2 2，选育耐高渗透压的菌株，选育耐高渗透压的菌株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种3 3，选育不分解利用谷氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为，选育不分解利用谷
8、氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种4，选育细胞膜渗透性好的突变株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种5，选育强化CO2固定反应的突变株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种6，选育减弱乙醛酸循环的突变株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种7，选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸代谢的突变株 第三节 谷氨酸生产菌的育种8，选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种9，选育强化
9、能量代谢的突变株 第三节第三节 谷氨酸生产菌的育种谷氨酸生产菌的育种10，选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株 第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌产菌 一、应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌一、应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌1)标记标记菌株的筛选筛选；2)原生质质体的制备备；3)原生质质体的再生；4)原生质质体的融合；5)融合子的选择选择；6)实实用性菌株的筛选筛选。第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌产菌 二，应用转化法选育谷氨酸生产菌二，应用转化法选育谷氨酸生产菌 所谓转化，是指受体细胞直接吸
10、收了来自供所谓转化，是指受体细胞直接吸收了来自供体细胞的体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。转化作用需要受体菌和转化象。转化作用需要受体菌和转化DNA。转化既。转化既是进行细菌遗传分析的有效工具，亦是微生物是进行细菌遗传分析的有效工具，亦是微生物育种的有效方法。育种的有效方法。第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌产菌 三，应用转导法选育谷氨酸生产菌三，应用转导法选育谷氨酸生产菌 所谓转导，是指通过温和型噬菌体为媒介，将供体细脑中的所谓转
11、导，是指通过温和型噬菌体为媒介，将供体细脑中的DNA片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞部分遗传性状的现象。转导作用需要三个组成部分，即供体菌，部分遗传性状的现象。转导作用需要三个组成部分，即供体菌，转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌(包括谷氨酸生产菌在包括谷氨酸生产菌在内内)都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又因为转导都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又因为转导DNA位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化DNA那样容易那样容易被外界的被外界的DN
12、A分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，也是微生物育种的有效方法。也是微生物育种的有效方法。第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌产菌 四、应用重组四、应用重组DNA技术选育谷氨酸生产菌技术选育谷氨酸生产菌 重组重组DNA技术也称为基因工程，它是在分子遗传技术也称为基因工程，它是在分子遗传学理论的基础上发展起来的。它综合了生物化学和微学理论的基础上发展起来的。它综合了生物化学和微生物学的现代技术和手段在离体条件下将某种生物的生物学的现代技术和手段在离体条件下将某种生物的基因与作为载体的基因与作为载体的DN
13、A分子连接起来，然后转化到某分子连接起来，然后转化到某一寄主细胞中，使之进行复制并得以表达，从而使寄一寄主细胞中，使之进行复制并得以表达，从而使寄主菌获得新的遗传性状。利用重组主菌获得新的遗传性状。利用重组DNA技术，可以使技术，可以使编码限速酶的基因扩增以排除生物合成途径中的编码限速酶的基因扩增以排除生物合成途径中的“瓶瓶颈颈”，从而使谷氨酸产量增加。因比重组，从而使谷氨酸产量增加。因比重组DNA技术是技术是提高谷氨酸产量的一种新的有效手段。提高谷氨酸产量的一种新的有效手段。第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌产菌 五、应用固定化细胞技术发酵生产谷氨
14、酸五、应用固定化细胞技术发酵生产谷氨酸 固定化细胞是固定化细胞是60年代后期发展起来的一项新技术，年代后期发展起来的一项新技术，是通过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间内是通过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间内使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既能保持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方能保持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方便地与反应液分离，并能进行重复使用，所以对原材便地与反应液分离，并能进行重复使用，所以对原材料的合理利用，缩短不必要的操作时间，防止环境污料的合理利用，缩短不必要的操作时间，防止环境污染及进行现代
15、化的工业生产部具有重要的现实意义。染及进行现代化的工业生产部具有重要的现实意义。在谷氨酸生产中，依其代谢途径，把不必要的代谢途径(经诱变阻断了a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸两条代谢途径)切断后，同时诱变出细胞渗漏型甘油缺陷 B 4，以便让谷氨酸有效外漏，解除因代谢途径改变后细胞内代谢产物谷氨酸过度积累而产生的反馈抑制，谷氨酸产量有一定提高(经诱变筛选得到的营养缺陷型突变株 B 4比其出发菌株 B l提高产酸率 18.6 和对糖的转化率提高 12.3)。1.1，菌株和质粒 1.2 培养基和培养条件1.2 培养基和培养条件1.3 DNA的提取与纯化1.4 PCR克隆pfkA基因1.5 重组质粒
16、Ku一1的构建及重组菌的筛选和鉴定1.6 重组质粒的稳定性 1.7 磷酸果糖激酶活性测定 1.8 糖转化率和谷氨酸生成比较 结结果：经经基因工程改造后的 B 4 4对对糖的转转化率有所提高，谷氨氨酸产产量有较较大的提高，这这主要是增大磷酸果糖激酶剂剂量，解除了EMP途径径中的磷酸果糖激酶的限制，以致解除了磷酸果糖激酶对对已经经改造的谷氨氨酸整个个代谢谢途径径的限制，故物流代谢谢增强。以致B44对对糖的转转化率有所提高，谷氨氨酸产产量有较较大的提高。第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即；斜面菌种-一级
17、种子培养-二级种子培养-发酵罐。第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养1斜面菌种的培养第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养2一级种子培养 第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养2一级种子培养 第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养3二级种子培养 (1)培养基组成第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养3二级种子培养第五节第五
18、节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 一，菌种的扩大培养3二级种子培养第五节第五节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 二，影响种子质量的因素1培养基构成：种子培养基要求合有丰富的氮源，足够的生物素，少量的碳源，以利于菌体生长。如果糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使PH降低菌种容易衰老。2温度；幼龄菌对温度变化敏感，应避免温度过高和波动大。3PH值：零小时时PH不宜过高，培养结束PH不宜过低，PH上升后有所下降时，培养时间已接近结束。4溶解氧：长菌阶段对氧要求比发酵时低，溶氧水平过高，抑制长菌。5接种量：种量过少，菌体增长缓慢，适应
19、期长，培养时间长，影响种子活力。但种量过大，在拼瓶操作中易引起污染。一般种且以1左右为宜。6培养时间：培养时间不宜太长，以78h为好，掌握对数生长期作为种子接入发酵罐。谷氨酸生产的种子制备谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级二级种子培养种子培养发酵发酵（1）斜面）斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生
20、长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次（2）一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基（3）二）二级级种子种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基（4）种子的质量要求：）种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛
