1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他
2、分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构思考思考4 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取，人的红细胞无的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红
3、蛋白。富便于提取血红蛋白。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白
4、质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶
5、颗粒的内部，路程长，流动慢洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于凝胶颗粒空小于凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较
6、慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱洗脱先从凝胶柱洗脱出来出来后从凝胶柱洗脱后从凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-在一定范围内，能够抵制在一定范围内，能够抵制 对溶对溶液液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH 不变。不变。通常由通常由 溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂调节缓冲剂 的就可以制得在的就可以制得在 使使用的缓冲液。用的缓冲液。,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察()和科和科 学研究学研究()磷酸缓冲液磷酸缓冲液外界
7、的酸和碱外界的酸和碱基本基本12 种缓冲剂种缓冲剂使用比例使用比例不同不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3带电粒子在带电粒子在 作用下发生作用下发生 的过程。的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有具有 的基团，在一定的的基团，在一定的PHPH下，这些基团会带下，这些基团会带上上 或或 。在电场的作用下，这些带电分子在电场的作用下，这些带电分子会向着的会向着的 的电极移动。电泳利用的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子了待分离样品中各种分子 以
8、及分子以及分子本身的本身的 、的不同，使带电分子产生不同的不同，使带电分子产生不同的的 ，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。电场电场迁移迁移可解离可解离正电正电负电负电与其所带电荷相反与其所带电荷相反带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定运动方向运动方向电场电场作用力作用力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼
9、最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。脂糖凝胶。琼脂糖琼脂糖有一个相对较大的孔径，用有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（1 1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋
10、白质形成蛋白质-SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（迁移率完全取决于（）。）。分子的大小分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳检测电泳检测PCR结果结果二、实验步骤二、实验步骤 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定（电泳）纯度鉴定（电泳）样品处理样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离
11、步骤粗分离：粗分离：纯化：纯化：纯度鉴定纯度鉴定透析透析去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质用用凝胶色谱法凝胶色谱法除去相对分子质量较大的除去相对分子质量较大的杂质杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（
12、）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（每个肽链环绕（），此），此基团可携带（基团可携带（）。）。血红蛋白因含有（血红蛋白因含有（）而呈红色。本课）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为质量分数为0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）
13、重复重复4、5步骤（步骤（）次，直至上清）次，直至上清液中已没有（液中已没有（），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。涤次数过少。五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水三三黄色黄色1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 为什么要低速短时离心？防止白细胞沉淀C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间低速短时间五倍体积的生理盐水五倍体积的生理盐水三次三次 上清液不再呈现黄色，上清液不再呈现黄
14、色，表明红细胞已洗涤干净表明红细胞已洗涤干净不能，不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，而不至于破裂，若红细胞若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。，加大分离难度。D、为什么要缓慢搅拌？、为什么要缓慢搅拌？防止红细胞破裂释放出血红蛋白。防止红细胞破裂释放出血红蛋白。初次离心后的结果3次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞溶解细胞膜膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）
15、分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白血红蛋白.原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水（2）释放血红蛋白）释放血红蛋白思考：思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？（蒸馏水，（蒸馏水，40%体积的甲苯）体积的甲苯）2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：目的分析：1.蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀
16、裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉
17、淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色用滤纸过滤，除去脂溶性用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，置片刻后，分出下层的红分出下层的红色透明液体色透明液体。取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，小时，透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0(4)透析透析1 2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）（1）用 方法进行粗分离，透析袋由硝
18、酸纤维素制成，又称 。将透析袋放入 溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是 。透析透析玻璃纸玻璃纸 透析袋能使小分子自由进出，而将透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲磷酸缓冲 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？有机物？半透膜的选择透过性，大分子物质不能通半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半
19、透膜扩散进入到小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。的磷酸缓冲液中。透析过程中为何使用透析过程中为何使用pH7的磷酸缓冲液？的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。子充分地向外扩散。（1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，
20、再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）、纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量去除相对分子量较大的杂质蛋白较大的杂质蛋白 凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定量的凝胶浸泡于量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分中充分溶胀溶胀后，配成后，配成凝
21、胶悬浮液凝胶悬浮液。A A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性一次性缓慢倒入色谱柱缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果果。洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶
22、，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()()高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液（液（pHpH为为7.07.0）充分（）充分（）1212小时。小时。洗涤平衡洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。新填装。50cm50cm 教材教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、为什么凝胶的装
23、填要紧密、均匀？均匀？如果装填如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。质的洗脱次序，影响分离的效果。装配好的凝胶柱(3(3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓慢下）缓慢下降到与（降到与（）平齐，）平齐，关闭出口关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面加加透析透析样样品品调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶
24、面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（）将）将1ml（）的样品加到色谱柱的（的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：收集：待（待（）接近色谱柱底接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集收集一试管连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质4、纯度鉴定（电泳）、纯
25、度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1、垂直板电泳装置、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）、微量进样器（可用微量移液器代替）（5）装槽、点样：）装槽、点样：拔出梳子拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）一侧向内）在电泳槽中加入缓冲液在电泳槽中加入缓冲液 点样。点样。（6）电泳：）电泳：（7)、剥胶、染色及脱色、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色
26、，然后用脱色液脱色。色，然后用脱色液脱色。(8)、结果、结果观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-5-1818），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述
27、处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说
28、明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶
29、色谱柱的装填有关。装填有关。鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲甲双双丙烯酰胺的贮存液。丙烯酰胺的贮存液。用去离子水用去离子水配成配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。作用通过催化过硫酸铵形成自由基作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。的自由基
30、。此溶液须配制新鲜液。25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)HCl(pH 6.8)，100 100 mmol/L DTT(mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的
31、甲醇，10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋的冰醋酸。酸。1 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。致命。3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要
32、戴好一次性手套。步骤完成。操作时要戴好一次性手套。在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，在体积比加入样品处理液，在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 L25 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色即进行凝胶色谱分离之前谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品的样品和凝胶色谱分离之后的样品将电泳将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当
33、染料前沿进入分离。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。去一角，以标注凝胶的方位。将电泳凝胶片放在考马将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色斯亮蓝染色液中染色1-2 h1-2 h。染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-
34、10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。，其间需多次更换脱色液至背景清楚。SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度。的结合程度。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红鉴定血红蛋白纯度蛋白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺
35、用去离用去离子水配制子水配制29%29%（29 g/100 29 g/100 mLmL，下同）的丙烯酰，下同）的丙烯酰胺和胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制用去离子水配制10%10%
36、过硫酸铵：作用提供驱过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。基。此溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 25 mmolmmol/L/L TrisTris，250 250 mmolmmol/L/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 50 mmolmmol/L/L TrisTrisHCl(pHHCl(pH 6.8)6.8)，100 100 mmolmmol/L DTT(/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用
37、或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲的甲醇，醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、
38、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备用去离子水用去离子水4.6 4.6 mLmL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 2.7 mLmL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的T
39、risTris缓冲液缓冲液2.5 2.5 mLmL，10%10%的的SDS 0.1 SDS 0.1 mLmL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 0.1 mLmL，TEMED TEMED 0.006mL0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子梳子的齿长再加的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入，再在胶液面上小心注入一层水（约高一层水（约高2 23 mm3 mm），以阻止氧气进入凝），以阻止氧气进入凝胶溶液。胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤配制配制
40、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水用去离子水2.7 2.7 mLmL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 0.67 mLmL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 0.5 mLmL，10%10%的的SDS0.041 SDS0.041 mLmL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 0.04 mLmL，TEMED TEMED 0.004 0.004 mLmL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。胶上，并立即在浓缩胶溶
41、液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。盖水层，再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序
42、加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 25 LL。样。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分的样品和凝胶色谱分离之后的样品离之后的样品4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。部两玻璃板之间的气泡。7 7）剥胶）剥胶 从电
43、泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。部切去一角，以标注凝胶的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶，继续电泳直至溴酚蓝到达分
44、离胶底部上方约底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。10)10)观察结果：观察结果：9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景，其间需多次更换脱色液至背景清楚。清楚。观察你处理的血液样品离心后是否分层观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），如果分层不明显，），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，长，
45、会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。蛋白的提取纯度。三三 实验结果分析与评价实验结果分析与评价由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱
46、柱的性能良好。如狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，质的分子量时，可选用一组已知分子量的可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，率和分子量的对数作标准曲线，可以测定可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售售
