1、支气管哮喘 的中药药效研究思路和方法 概述?支气管哮喘（bronchial Asthma）是机体对抗原性或非抗原性刺激引起的一种气管-支气管反应性过度增高的疾病，简称哮喘。已成为严重威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织统计，全球约有哮喘患者1亿6千万，年死亡率在0.9-5%之间，每年约有10万人死于哮喘。哮喘在我国发病率约24%，最保守估计全国的支气管哮喘患者约在一千万以上，其中儿童就有400万。虽然人们的生活水平及医疗卫生在不断进步，但有令人信服的证据表明哮喘的患病率及死亡率仍呈上升趋势，随着工业发展，大气污染加重及社会生活节奏加快，哮喘的发病率和死亡率有逐年增加趋势。?过去认为哮喘是Ig
2、E介导的型变态反应性疾病，但目前认识到支气管哮喘是以气道高反应为主要特征的慢性气道炎症性疾病。哮喘发病分速发相和迟发相两个阶段。在速发相中肥大细胞为主要效应细胞，致敏原与肥大细胞表面IgE抗体结合，导致肥大细胞脱颗粒反应，释放组织胺、5-羟色胺等炎症介质，引起支气管痉挛、气道粘膜微血管通透性增加、气道粘膜水肿及粘液分泌亢进。迟发相哮喘反应的特征是大量嗜酸性粒细胞（Eosinophil，EOS）浸润，EOS能产生多种毒性蛋白，如主要碱性蛋白（Major Basic Protein，MBP）可直接损伤气道上皮和肺组织，引起气道上皮剥离和气道高反应性（Airway hyperresponsivene
3、ss，AHR）。支气管哮喘属祖国医学“哮喘”范畴，并认识到哮喘病变部位主要在肺，哮喘的发生强调内外因相合为患。病 因?引发哮喘的原因错综复杂，包括遗传素质、精神心理状态、内分泌及个体健康状况、免疫状态等内在因素，同时与变应原、感染、职业、气候、药物、环境等外因有关。但变应原是引起哮喘的最主要原因之一。引起人体哮喘的变应原已达数千种之多，其中主要变应原包括花粉类、飞尘、螨、霉菌、动物皮毛和蟑螂等。因此，变应原侵入呼吸道被认为是启动支气管哮喘病人体内一系列免疫学变化的关键因素。Ag Th B IgE APC IL-1、IL-6 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、IL-16 病 机
4、?肥大细胞是哮喘速发相的主要效应细胞 肥大细胞（MC）是介导I型变态反应的重要成分之一，主要参与速发相反应。IgE MC Ag 脱颗粒 组胺、趋化剂、白三烯、前列腺素、血小板活化因子及多种酶类 引起平滑肌收缩、粘膜水肿、血管通透性增高 效应?嗜酸性粒细胞浸润气道 导致慢性炎症反应 外周血、气道和痰中EOS数目增多是支气管哮喘的主要特征，EOS在气道高反应性形成中起重要作用。气道炎症是气道高反应性发生的病理基础，气道高反应性是哮喘的特征，因此哮喘也被命名为“慢性嗜酸性细胞支气管炎”。?肺泡巨噬细胞的抗原递呈作用及其分泌的炎症介质参与哮喘发病?TH1和TH2平衡紊乱 Th0 Th1 Th2 细胞免
5、疫 IL-2，IFN-，TNF-?体液免疫 IL-4，IL-5，IL-9，IL-10，IL-13和GM-CSF?一氧化氮、内皮素和白三烯在哮喘发病中的作用 参与哮喘的炎症介质已达50多种，其中一氧化氮（NO）、内皮素（ET）、LTs等是当前研究热点。?NO在哮喘发生机制中的作用比较复杂，低浓度时NO对支气管平滑肌有舒张作用，但大量NO时，可引起细胞毒性，特别是导致气道上皮细胞损伤。?ET是一种由血管内皮细胞合成的、作用持久的、能引起血管强烈收缩的肽类物质。ET和ET受体广泛地存在于肺组织血管、气管、支气管上皮细胞及肺组织中的巨噬细胞内。肺既是ET的靶器官，又是ET合成和代谢场所。?LTs是哮喘
6、慢性呼吸道炎症中重要的炎症介质，主要包括LTB4、LTC4、LTD4及LTE4。研究表明LTs可直接引起支气管平滑肌收缩，尤其以LTC4和LTD4作用最强，吸人LTC4和LTD4可引起强烈支气管收缩。与组胺的作用不同，它们对周围呼吸道的作用尤为显著。研究思路?1.改善肺通气功能，降低效应器官即支气管的反应性?2.抑制EOS在呼吸道中浸润所致的炎症反应?3.调节IgE抗体生成和反应?4.对炎症细胞膜稳定性的影响?5.阻断或拮抗各种细胞因子和炎症介质释放?6.对微循环的影响?7.调节TH1/TH2平衡?8.改善哮喘症状及调节植物神经系统功能 改善肺通气功能，降低效应器官即支气管的反应性改善肺通气功
7、能，降低效应器官即支气管的反应性?不论是哮喘速发阶段的气道平滑肌痉挛，还是迟发阶段的气道炎症，最终导致了患者气道高反应性的产生、肺通气功能下降。?中药能否改善哮喘患者呼吸道的高反应性，是其疗效的直接反应，因此，对中药新药研究应重视这项指标。临床研究常通过测定患者的肺功能观察药物对支气管反应性的影响；动物研究进行的较少。?温阳通络合剂(红参、制附子、淫羊藿、干美、炙黄芪、当归、炙麻黄、远志、桑白皮、生石膏、五味子、炙甘草)治疗哮喘后，肺功能和呼气流速峰值、1秒钟用力呼气量都有明显增加，气道阻力减小，肺通气功能增强。?进行体外试验显示川芎嗪能舒张气管的螺旋条，研究认为川芎嗪具有稳定细胞膜电位，抑制
8、气道高反应的作用。?通过测定了哮喘豚鼠气道反应性，观察益气温阳护卫汤（生黄芪、白术、防风、桂枝、白芍、生姜、大枣、炙甘草、仙茅、仙灵脾等）的作用；结果表明益气温阳护卫汤具有显著降低哮喘豚鼠支气管反应性的作用。抑制EOS在呼吸道中浸润所致的炎症反应?正常豚鼠吸入含EOS成分溶液后，造成气道上皮的损伤，脱落，并形成气道高反应性，证明EOS在气道高反应形成中的作用；哮喘患者体内EOS数量与气道高反应性呈明显正相关。观察肺泡灌洗液中以嗜酸性细胞为主的炎性细胞的变化和肺组织炎症病理改变，可作为抗迟发相哮喘反应的疗效指标。?涤痰散（胆星、建曲、巴豆等）通过明显降低哮喘大鼠血中EOS数目，从而减轻、抑制了E
9、OS在气道组织中的聚集、浸润及释放炎症介质。?虫草菌粉能显著抑制致敏豚鼠再次受到抗原攻击后支气管内EOS的聚集反应。?柴朴汤则有抑制哮喘患者气道粘附因子等对EOS的吸附作用；?雷公藤甲素可显著降低哮喘患者及哮喘豚鼠血中EOS数量，其机理可能是雷公藤甲素直接作用于活化的CD4细胞，抑制IL-5的产生而间接作用于EOS，也可能是显著增加EOS调亡的数量。调节IgE抗体生成和反应?IgE分为总IgE和抗原特应性IgE。总IgE是哮喘特应性体质的标志，而特异性IgE介导抗原特异性速发型变态反应。?观察中药调节IgE抗体尤其是抗原特应性IgE的影响，是判断中医药对哮喘速发相的疗效的重要指标。?沈自尹等采
10、用补肾治疗哮喘，药用附子、生地、熟地、仙灵脾、补骨脂、菟丝子等组成温阳方防治支气管哮喘，发现温阳方可使哮喘患者血清总IgE和尘螨特异性IgE的季节性升高受到明显的抑制，实验也进一步证明这种免疫调节作用是通过提高哮喘患者已降低的Ts细胞功能来进行的。?应用雷公藤水煎剂治疗支气管哮喘并进行动物实验观察发现，雷公藤可使患者治疗后总IgE、嗜碱性粒细胞计数均较治疗前有显著降低，但特异性IgE无明显变化 对炎症细胞膜稳定性的影响对炎症细胞膜稳定性的影响?在哮喘速发相反应中，肥大细胞是主要的效应细胞，机体首次接触抗原后致敏，产生特异性IgE抗体，并与肥大细胞、嗜碱性粒细胞膜上IgE Fc段高亲和力受体结合
11、，当再次吸入同类抗原时，多价抗原与特异性IgE抗体结合，相邻两个FcRI 发生桥联，最终导致肥大细胞、嗜碱粒细胞等炎症细胞脱颗粒，释放多种炎症介质。因此，具有稳定肥大细胞膜作用的药物，能有效地抑制炎症介质的释放，减轻炎症反应。?如当归、红花对整体豚鼠实验性喘息具有保护作用，二者均可以延长引喘潜伏期，通过肥大细胞脱颗粒实验发现当归和红花可以抑制肥大细胞脱颗粒，其抑制率大于30%，通过小鼠被动皮肤过敏实验发现当归和红花均可抑制小鼠的被动皮肤过敏，因此推测当归、红花防治哮喘的机理在于稳定肥大细胞膜、抑制炎性介质的释放。阻断或拮抗各种细胞因子和炎症介质释放阻断或拮抗各种细胞因子和炎症介质释放?IL-4
12、、IL-5、IFN-等细胞因子在哮喘迟发相哮喘反应中起重要作用，气道中IL-1、NO、ET、LTs等炎性因子在哮喘发病中也很重要。目前在中药治疗哮喘的研究中，观察细胞因子和炎症介质的变化的报道较多。?采用补肾健脾固本法（仙灵脾、巴戟天、蛇床子等）治疗大鼠支气管哮喘的研究中发现，本法可下调血浆和BALF中IL-5，抑制BALF中NO、ET-1的合成和释放，从而减轻哮喘气道炎症及气道上皮重建，降低气道高反应性。?平喘口服液口服可显著降低哮喘豚鼠血液中包括ET、NO、血栓素B2（TXB2）在内的多种炎性介质的含量。现已明确认识到前列腺环素(PGI2)与血栓素(TXA2)比值是某些药物引起支气管平滑肌
13、收缩或舒张的重要机制之一，平喘药物的支气管平滑肌舒张作用与PGI2TXA2值成正相关。对微循环的影响对微循环的影响?哮喘患者大多伴有微循环障碍，其障碍程度随病情加重而递增，经活血化瘀法治疗后，血液流变学得到改善；另一方面，气道反应性炎症，往往表现为气道粘膜水肿、增生、破坏、微血管充血、阻塞、微循环障碍等病理状态，重用活血化瘀药物，可改善其血循环，增加血供，氧供，有利于气道炎症的愈合，从而达到平喘和恢复体质的目的。调节TH1/TH2平衡?TH1释放的细胞因子和TH2细胞释放的细胞因子之间的比例失衡已被视为哮喘发病的主要免疫学机制。因此，从调整TH1/TH2平衡着手研究中医药治疗支气管哮喘是符合哮
14、喘的研究方向。但目前从此角度对中药进行研究的报道相对较少。?芩夏止哮颗粒（柴胡、半夏、葶苈子、全瓜蒌等）能显著降低哮喘模型小鼠BALF和脾脏中TH2细胞因子IL-4和IL-5水平，对TH1细胞因子IFN-则有升高作用，表明本方具有促进哮喘小鼠体内TH1/TH2平衡的作用。?益气温阳护卫汤除能降低支气管哮喘高反应外，还可以调节TH1/TH2平衡，即促进Th1细胞分泌IFN-，抑制Th2细胞分泌IL-4，IL-5，调节Th1、Th2细胞因子的有效选径是通过降低NO水平实现的。?此外，许多学者对应用了雷公藤制剂的哮喘患者的T淋巴细胞进行了研究，表明雷公藤制剂可使CD8+T细胞明显升高，CD4+T细胞
15、显著降低，改变CD4+T/CD8+T细胞比例变化，它不仅能提高体内抑制细胞的比例，更重要的是加强了抑制细胞的活性，抑制过度的免疫反应，纠正和恢复机体免疫平衡。改善哮喘症状及调节植物神经系统功能改善哮喘症状及调节植物神经系统功能?支气管哮喘的临床典型症状为咳嗽、咳痰，很多中药具有显著的止咳化痰作用，可参考相关文献进行化痰、镇咳及抗一般性炎症的研究。?益肺平喘丸（人参、鹿茸、蛤蚧、珍珠、地龙、僵蚕、细辛、麻黄）对豚鼠实验性哮喘和小鼠实验性咳嗽均有明显的保护作用，并能增加小鼠呼吸道酚红排出量。研究方法?根据哮喘动物模型研究进展及国内实际情况，可采用卵蛋白（OVA）致敏和卵蛋白雾化吸入攻击引起豚鼠EO
16、S浸润为主的气道炎症实验模型进行研究，对中药治疗哮喘机理研究建议采用卵蛋白致敏攻击的小鼠模型。?长期以来OVA致敏和攻击的豚鼠模型较为常用，但该模型的缺点是过敏反应由IgG介导，而且豚鼠特异性的免疫检测试剂较少，防碍了与哮喘有关的免疫机制方面的研究。也有用狗、猴子、兔子等动物做哮喘模型，但因动物来源困难价格昂贵，基因异源性等缺点而受到限制。?国外现已多采用小鼠哮喘模型研究哮喘发病机制，因为在小鼠肺部炎症中主要介导的抗体是IgE，与人相似，而且许多介导炎症的免疫成分和细胞因子在小鼠身上可以获得研究。但目前在国内中医药研究中使用小鼠哮喘模型少见报道。动物模型?卵蛋白致敏攻击的豚鼠哮喘模型?小鼠哮喘
17、模型?大鼠致敏模型 卵蛋白致敏攻击的豚鼠哮喘模型卵蛋白致敏攻击的豚鼠哮喘模型?原理 哮喘临床病人主要表现为 EOS浸润为主的气道炎症高反应特征，用卵蛋白致敏的豚鼠在抗原攻击后出现的病理变化与哮喘病人相似，故可作为哮喘理想的动物模型。?方法 抗原致敏和攻击：实验选用 250350g豚鼠，雌雄各半，每只豚鼠用 10mg卵蛋白肌肉注射致敏，34周后，将豚鼠置密闭有机玻璃箱中，用 0.51%卵蛋白超声雾化吸入 2min进行攻击。小鼠哮喘模型小鼠哮喘模型?原理 小鼠哮喘模型与人类哮喘在发病机制上更加相似。参与哮喘发病的主要抗体为 IgE，和人类相同。?方法 实验选用雌性纯系小鼠，第 0天、第7天每只小鼠
18、腹腔注射0.2ml的致敏原/PBS溶液（含100g OVA和1mgAl(OH)3）致敏。第1420天将小鼠放入自制玻璃罩内，用超声雾化器给小鼠喷雾6%OVA/PBS 溶液，每天30分钟，对小鼠进行攻击。至第21天，模型制备完成。大鼠致敏模型大鼠致敏模型?原理 气道炎症形成过程中，致敏肥大细胞受抗原刺激，降低了细胞膜的稳定性，导致细胞脱颗粒，释放炎症介质，引起气道炎症。?方法 150-200g SD或Wistar大鼠用卵白蛋白1mg/只肌肉注射，同时腹腔注射百日咳1?109作为佐剂使大鼠致敏，1421天后，将大鼠颈动脉放血处死，用Hanks液冲洗腹腔，收集腹腔冲洗液，置于塑料试管中（以上试验步骤
19、均在4下进行）。500?g离心5min，去上清，沉淀用适量缓冲液摇匀，即为大鼠腹腔肥大细胞悬液，测定其脱颗粒和组胺的释放。客观指标?对哮喘动物气道炎症的影响对哮喘动物气道炎症的影响?测定支气管肺泡灌洗液中炎症细胞（细胞总数及单核/巨噬细胞、淋巴细胞、EOS及嗜中性粒细胞的百分率）、支气管肺泡病理切片检查。?炎症细胞膜稳定性的影响炎症细胞膜稳定性的影响?测定致敏动物肥大细胞脱颗粒及组胺释放，测定哮喘动物EOS释放的阳离子蛋白，测定哮喘动物血液中白细胞或组织释放的白三烯。?哮喘气道反应性哮喘气道反应性?用生理记录仪记录哮喘豚鼠用不同浓度的组胺诱导的气管内压力变化。?对免疫功能的影响对免疫功能的影响
20、?测定血清中总IgG及特异性IgG，T细胞增殖反应，测定小鼠血清中和BALF中的TH1/TH2相关的细胞因子，TH1分泌的细胞因子可重点测定 IFN-和IL-2，TH2分泌的细胞因子可重点测定 IL-4和IL-5。通过测定细胞因子的含量变化判断药物对 TH1/TH2的调整作用。以上各种细胞因子的测定方法可采用相应的ELISA试剂盒?对炎症介质的影响对炎症介质的影响?可选用大鼠作为皮肤血管通透性模型，在同一动物的背部皮内多点注射多种炎症介质，如组胺、白三烯、前列腺素、血小板激活因子等，动物给药后，观察大鼠各炎症介质在皮肤上的反应。?此外还可根据药物的作用特点选择其他指标，如对血液流变学的影响、对糖皮质受体的影响等。
