1、 12019-1-302019-1-3023456789识别序列 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。也有少数限制酶识别序列由4、5、或8个核苷酸组成。10111213平末端平末端141516E.coliDNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘性末端的连接T4DNA连接酶 从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘性末端的连接，又能用于平末端的连接，但是平末端的连接效率低。17为什么要用运载体？1819202122原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构(补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点
2、聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子23真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白
3、质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子24原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码2526供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADN
4、A用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶271 1、目的基因的获取、目的基因的获取1 1目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成28概念：基因文库概念：基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库）将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片
5、段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因分别含有这种生物的不同的基因,称为基因称为基因文库文库(gene library)29基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基基因文库中包含了一种生物所有的基因因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.30基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系31cDNAcDNA文库的构建文库的构建mR
6、NA 反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶聚合酶双链DNA反转录法：反转录法：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA32基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较33如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等
7、特性。34利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。3536v 人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成373 3、基因表达载体（重组质粒）的构建、基因表达载体（重组质粒）的构建（1 1）用一
8、定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1 1过程过程:382 2基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止
9、子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞3940质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种过程过程:412、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：
10、作为基因工程表达载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？424344451、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌46
11、（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。47（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），
12、使目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。482、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物493、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大
13、肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA5051(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定5253知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配
14、对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。5455DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd56复习题复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方）将目的基因导入受体细胞有哪些方法法?(试举例说明试举例说明)2）简述农杆菌转化法）简述农杆菌转化法57非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核585960616263
