1、专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离,栏目链接,栏目链接,蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作,栏目链接,请思考： 1怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？ 2用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？,栏目链接,栏目链接,1概念 _是根据_分离蛋白质的有效方法，也称作分配色谱法。,一、凝胶色谱法血红蛋白的分离方法,凝胶色谱法,相对分子质量的大小,多孔球体,多糖类化合物
2、,贯穿的通道,栏目链接,(2)分离原理： 相对分子质量较小的蛋白质：容易进入_的通道，路程_，移动速度较慢，通过凝胶柱的时间_。 相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程_，移动速度较快，通过凝胶柱的时间_。,凝胶内部,较长,较长,较短,较短,栏目链接,二、缓冲溶液,1作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制_对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 2配制 通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的_就可以制得在_的缓冲液。,外界的酸和碱,使用比例,不同pH范围内使用,栏目链接,三、电泳血红蛋白的分离或鉴定方法,1概念 带电粒子在_的作用下发生_的过程。 2
3、原理 (1)许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有_，在一定的pH下，这些基团会带上_或_。,电场,迁移,可解离的基团,正电,负电,栏目链接,(2)在电场的作用下，这些带电分子会向着_移动。 (3)电泳利用了待分离样品中各种分子_以及分子本身的_、_的不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。,与其所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,栏目链接,四、蛋白质的提取和分离过程,蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、粗分离、_和纯度鉴定。,样品处理,纯化,栏目链接,栏目链接,一、血红蛋白的提取和分离的原理,1蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析,栏目链接,2.电泳
4、原理及方法 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。,栏目链接,栏目链接,例1关于电泳的说法不正确的是( ) A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带
5、净电荷的多少 D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小,栏目链接,解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案：C,栏目链接,变式 训练,1凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( ) A具有相同的相对分子质量 B相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子 C相对分子质量不同，但都是相
6、对分子质量较小的分子 D具有相对分子质量不同的蛋白质,栏目链接,变式 训练,解析：若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝捍材谝贫嗬虢隙蹋肿咏闲囊贫嗬虢铣谑欠肿咏洗蟮南韧床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现出分子筛效应。 答案：D,栏目链接,二、血红蛋白的提取和分离的实验操作,1
7、样品处理 (1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。,栏目链接,(2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况：第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。 (4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。,栏目链接,2凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的装填
8、： 装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。 凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。 装填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。,栏目链接,(2)样品的加入和洗脱： 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 按正确方法加样，不能破坏凝胶面。 进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。,栏目链接,例2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是( ) A增大蛋白质的相对分子质量 B改变蛋白质分子的形状 C掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别 D减少蛋白质分子的相
9、对分子质量,栏目链接,解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案：C,栏目链接,2下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是( ) A蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小 B蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小 CSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白
10、质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离 D凝胶中加入SDS可以消除净电荷对迁移率的影响,变 式 训 练,栏目链接,解析：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然,变 式 训 练,栏目链接,蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低。 答案：A,变 式 训 练,栏目链接,
