1、原子力显微镜PPT课件第一代：光学显微镜第一代：光学显微镜 16世纪末，荷兰人Janssen发明了第一台复式显微镜 1665年，英国科学家罗伯特胡克用他的显微镜发现了细胞 1680年，列文虎克磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍第一代：光学显微镜第一代：光学显微镜列文虎克观察到的“小动物”罗伯特虎克观察到的细胞第一代：光学显微镜第一代：光学显微镜相较于过去两个世纪，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因：光学显微镜已经达到了分辨原因：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。率的极限。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2m。任何小于0.2m的结构都没法识别出来。提高显
2、微镜分辨率的途径是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。第二代：电子显微镜第二代：电子显微镜1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）扫描式电子显微镜SEM透射式电子显微镜TEM第二代：电子显微镜第二代：电子显微镜电子显微镜的分辨率可以达到纳米级电子显微镜的分辨率可以达到纳米级1.样品处理过程复杂样品处理过程复杂2.要在高真空的环境下操作要在高真空的环境下操作第三代：扫描探针显微镜第三代：扫描探针显微镜 1983年，IBM公司两位科学家G
3、erd Binnig和Heinrich Rohrer发明了扫描隧道显微镜（STM），但只能测导体和部分半导体 1985年，IBM公司Binning和Stanford大学的 Quate研发出了原子力显微镜（AFM），弥补了STM的不足STMSTM基本原理基本原理 隧道效应：隧道效应：量子力学认为，即使粒子能量小于阈值能量，很多粒子冲向势垒，一部分粒子反弹，还会有一些粒子能过去，好像有一个隧道，故名隧道效应。隧道电流随探针样品间距离减小而呈隧道电流随探针样品间距离减小而呈指数增加指数增加要求样品导电性要好，所以只能测导要求样品导电性要好，所以只能测导体和部分半导体。体和部分半导体。AFMAFM基本
4、原理基本原理AFMAFM是在是在STMSTM的基础上发展起来的。所不同的是，它不是利的基础上发展起来的。所不同的是，它不是利用电子隧道效应，而是用电子隧道效应，而是利用原子之间的范德华力作用来呈利用原子之间的范德华力作用来呈现样品的表面特性现样品的表面特性。吸引部分排斥部分F pair d原子原子排斥力原子原子吸引力AFMAFM基本原理基本原理 （1）将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触。（2）由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的力，会使悬臂产生微小的偏转。（3）通过检测出偏转量检测出偏转量并作用反馈控制其排斥力的恒定，就可以 获得微悬臂对
5、应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的图像。仪器构成仪器构成力检测部分力检测部分位置检测部分位置检测部分反馈电子系统反馈电子系统压电扫描系统压电扫描系统 压电装置在压电装置在X，Y，Z三个方向上精确控制样品或探针位置。三个方向上精确控制样品或探针位置。目前构成扫描器的基质材料主要是钛锆酸铅制成的压电陶瓷目前构成扫描器的基质材料主要是钛锆酸铅制成的压电陶瓷材料压电陶瓷有压电效应，即在加电压时有收缩特性，并且材料压电陶瓷有压电效应，即在加电压时有收缩特性，并且收缩的程度与所加电压成比例关系压电陶瓷能将收缩的程度与所加电压成比例关系压电陶瓷能将1mV1000V的电压信号转换成十几分之一纳
6、米到几微米的位移。的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米的位移。压电扫描系统压电扫描系统压电转换器压电转换器将机械作用和电信号相互转换的物理器件将机械作用和电信号相互转换的物理器件力检测部分力检测部分 检测的力是原子与原子之间的范德华力检测的力是原子与原子之间的范德华力 该部分是由悬臂和悬臂末端的针尖组成该部分是由悬臂和悬臂末端的针尖组成微悬臂是探测样品的直接工具，它的属性直接关系到仪器的微悬臂是探测样品的直接工具，它的属性直接关系到仪器的精密度和使用范围。精密度和使用范围。(1)极低的Z向弹性系数，其值为10-2102N/m。这样的微悬臂将极其灵敏，能够检测出小于1nN 的微小力。(2)足够
7、高的固有频率（10kHz），使AFM扫描时可以跟随表面轮廓的起伏。(3)足够小的微悬臂：其长度必须在微米尺度才能符合要求。用光束偏转来测量悬臂的偏转时，其灵敏度反比于悬臂的长度。(4)足够高的侧向刚性、以便尽可能地克服由于水平方向摩擦力造成的信号干扰。力检测部分力检测部分对微悬臂性能的要求对微悬臂性能的要求 (1)理想针尖的顶端应该是单个原子，这样的针尖能够灵敏地感应出它与样品表面之间的相互作用力。(2)较高的纵横比，尽可能小的曲率半径。(3)高的机械柔软性，针尖扫描时，即使撞击到样品的表面也不会使针尖损坏。(4)高的弹性形变，可有效地限制针尖在样品表面上的作用力，从而减小对样品的损害，对柔软
8、的生物样品特别有利。(5)稳定的结构。力检测部分力检测部分对针尖性能的要求对针尖性能的要求位置检测部分位置检测部分当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得微悬臂摆动，产当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得微悬臂摆动，产生微小的偏转，位置检测系统就是检测该偏转量的大小。生微小的偏转，位置检测系统就是检测该偏转量的大小。悬臂偏转的检测有四种方法：悬臂偏转的检测有四种方法：(1)电容测量法；(2)隧道电流检测法；(3)光学干涉测量法；(4)光束偏转测量法光束偏转测量法；为了得到高分辨的为了得到高分辨的AFMAFM，对检测方式一方面要求具有纳，对检测方式一方面要求具有纳米级的灵敏度，另一方面还要求
9、检测时不应该对微悬臂产生米级的灵敏度，另一方面还要求检测时不应该对微悬臂产生任何附加的作用力，避免造成信号误差。任何附加的作用力，避免造成信号误差。电容测量法电容测量法 微悬臂作为构成平行平板电容器的一块平板之一，而另一块平板则平行地位于微悬微悬臂作为构成平行平板电容器的一块平板之一，而另一块平板则平行地位于微悬臂上方。微悬臂的偏转值将通过测量该电容器的臂上方。微悬臂的偏转值将通过测量该电容器的电容值的变化电容值的变化得到。它的垂直位移得到。它的垂直位移检测精度达到检测精度达到0.03nm。位置检测部分位置检测部分 隧道电流检测法隧道电流检测法这种检测法在微悬臂的上方设有一个隧道电极，通过测量
10、微悬臂与隧道这种检测法在微悬臂的上方设有一个隧道电极，通过测量微悬臂与隧道电极之间电极之间隧道电流的变化隧道电流的变化就可以检测微悬臂的偏转。就可以检测微悬臂的偏转。位置检测部分位置检测部分 光学干涉测量法光学干涉测量法利用光学干涉的方法来探测微悬臂共振频率的位移利用光学干涉的方法来探测微悬臂共振频率的位移(或偏振光的相移或偏振光的相移)及及微悬臂偏转的幅度。微悬臂偏转的幅度。位置检测部分位置检测部分 光学偏转测量法光学偏转测量法它在微悬臂上的顶部设置了一面微小的镜子，通过检测小镜它在微悬臂上的顶部设置了一面微小的镜子，通过检测小镜子上子上反射光束的偏转反射光束的偏转就可以得到微悬臂偏转的信息
11、。就可以得到微悬臂偏转的信息。位置检测部分位置检测部分 光学偏转测量法光学偏转测量法二极管激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，二极管激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器。并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器。通过光电二极管检测通过光电二极管检测光斑位置的变化光斑位置的变化，就能获得被测样品表，就能获得被测样品表面形貌的信息。目前的面形貌的信息。目前的AFMAFM都是采用这种检测模式。都是采用这种检测模式。位置检测部分位置检测部分反馈电子系统反馈电子系统控制系统主要有两个功能：控制系统主要有两个功能：(1
12、)提供控制压电转换器提供控制压电转换器X-Y方向扫描的驱动电压；方向扫描的驱动电压；(2)在恒力模式下维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定在恒力模式下维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定数值计算机通过数值计算机通过A/D转换读取比较环路电压转换读取比较环路电压(即设定值与实际测即设定值与实际测量值之差量值之差)根据电压值不同，控制系统不断地输出相应电压来调根据电压值不同，控制系统不断地输出相应电压来调节节Z方向压电传感器的伸缩，以纠正读入方向压电传感器的伸缩，以纠正读入A/D转换器的偏差，从转换器的偏差，从而维持比较环路的输出电压恒定。而维持比较环路的输出电压恒定。电子线路电子线路
13、计算机系统计算机系统为压电陶瓷管提供电压、接收位置敏感器件传来的信号，并构为压电陶瓷管提供电压、接收位置敏感器件传来的信号，并构成控制针尖和样品之间距离的反馈系统。成控制针尖和样品之间距离的反馈系统。连接计算机与扫描系统连接计算机与扫描系统AFMAFM的三种工作模式的三种工作模式 1.接触模式（接触模式（Contact Mode）2.非接触模式（非接触模式（Non-Contact Mode）3.轻敲模式（轻敲模式（Tapping Mode）接触式工作模式接触式工作模式 在接触模式中，探针的针尖部分保持与样品表面接触，其主要作用力是在接触模式中，探针的针尖部分保持与样品表面接触，其主要作用力是库
14、仑排库仑排斥力斥力。微悬臂探针紧压样品表面，探针尖端和样品做柔软性的微悬臂探针紧压样品表面，探针尖端和样品做柔软性的“实际接触实际接触”，当针尖，当针尖轻轻扫过样品表面时，接触的力量引起悬臂弯曲，进而得到样品的表面图轻轻扫过样品表面时，接触的力量引起悬臂弯曲，进而得到样品的表面图形。形。van der Waals force curve接触式工作模式的特点接触式工作模式的特点（1）该方式可以稳定地获得高分辨率试样表面微观形貌图像，有可能达到原子）该方式可以稳定地获得高分辨率试样表面微观形貌图像，有可能达到原子级的测量分辨率。级的测量分辨率。（2）检测弹性模量低的软质试样时，试样表层在针尖力的作
15、用下会产生变形，）检测弹性模量低的软质试样时，试样表层在针尖力的作用下会产生变形，甚至划伤，这将使测出的表面形貌图像出现假象。甚至划伤，这将使测出的表面形貌图像出现假象。（3）针尖和试样接触并滑行，容易使探针尖磨损甚至损坏。）针尖和试样接触并滑行，容易使探针尖磨损甚至损坏。非接触式工作模式非接触式工作模式 针尖在样品表面的上方振动，始终不与样品接触，测量的作用力是以针尖在样品表面的上方振动，始终不与样品接触，测量的作用力是以范德华力范德华力为主的吸引力。为主的吸引力。探针回到当前行扫描的开始点，增加探针与样品之间的距离，根据第一次扫描探针回到当前行扫描的开始点，增加探针与样品之间的距离，根据第
16、一次扫描得到的样品形貌，始终保持探针与样品之间的距离，进行第二次扫描。在这得到的样品形貌，始终保持探针与样品之间的距离，进行第二次扫描。在这个阶段，可以通过探针悬臂振动的振幅和相位的变化，得到相应的长程力的个阶段，可以通过探针悬臂振动的振幅和相位的变化，得到相应的长程力的图像。图像。van der Waals force curve范德华吸引力非接触式工作模式的特点非接触式工作模式的特点（1）探针和试样不接触，针尖测量时不会使试样表面变形，适用于弹性模量低）探针和试样不接触，针尖测量时不会使试样表面变形，适用于弹性模量低的试样。的试样。（2）因针尖和试样不接触，测量不受毛细力的影响，同时针尖也
17、不易磨损。）因针尖和试样不接触，测量不受毛细力的影响，同时针尖也不易磨损。（3）非接触扫描测量模式测量灵敏度要低些。）非接触扫描测量模式测量灵敏度要低些。轻敲工作模式轻敲工作模式 一个外加的振荡信号驱动微悬臂在其共振频率附近做受迫振动，振荡的针尖轻一个外加的振荡信号驱动微悬臂在其共振频率附近做受迫振动，振荡的针尖轻轻的敲击表面，间断地和样品接触。轻的敲击表面，间断地和样品接触。用处于共振状态、上下振荡的微悬臂探针对样品表面进行扫描，样品表面起伏用处于共振状态、上下振荡的微悬臂探针对样品表面进行扫描，样品表面起伏使微悬臂探针的振幅产生相应变化，从而得到样品的表面形貌。使微悬臂探针的振幅产生相应变
18、化，从而得到样品的表面形貌。van der Waals force curve轻敲工作模式的特点轻敲工作模式的特点（1）轻敲模式的分辨率和接触模式一样好。）轻敲模式的分辨率和接触模式一样好。（2）对于一些与基底结合不牢固的样品，轻敲模式与接触模式相比，很大程度）对于一些与基底结合不牢固的样品，轻敲模式与接触模式相比，很大程度地降低了针尖对表面结构的地降低了针尖对表面结构的“搬运效应搬运效应”。（3）样品表面起伏较大的大型扫描比非接触式的更有效。）样品表面起伏较大的大型扫描比非接触式的更有效。（4）较软及粘性较大的样品，应尽量选择轻敲模式。）较软及粘性较大的样品，应尽量选择轻敲模式。AFMAFM
19、假象假象 在所有显微学技术中，在所有显微学技术中，AFMAFM图像的解释相对来说是容易的。光学显微镜和电子显微图像的解释相对来说是容易的。光学显微镜和电子显微镜成像都受电磁衍射的影响，这给它们辨别三维结构带来困难镜成像都受电磁衍射的影响，这给它们辨别三维结构带来困难AFMAFM可以弥补这些不可以弥补这些不足，在足，在AFMAFM图像中峰和谷明晰可见图像中峰和谷明晰可见AFMAFM的另一优点是光或电对它成像基本没有影响，的另一优点是光或电对它成像基本没有影响，AFMAFM能测得表面的真实形貌能测得表面的真实形貌尽管尽管AFMAFM成像简单，成像简单，AFMAFM本身也有假象存在相对来说，本身也有
20、假象存在相对来说，AFMAFM的假象比较容易验证下面介绍一些假象情况：的假象比较容易验证下面介绍一些假象情况：1.针尖成像针尖成像：AFM中大多数假象源于针尖成像针尖比样品尖锐时，样品特征就中大多数假象源于针尖成像针尖比样品尖锐时，样品特征就能很好地显现出来。相反，能很好地显现出来。相反，当样品比针尖更尖时，假象就会出现当样品比针尖更尖时，假象就会出现，这时成像主要，这时成像主要为针尖特征高表面率的针尖可以减少这种假象发生为针尖特征高表面率的针尖可以减少这种假象发生AFMAFM假象假象 2.钝的或污染的针尖产生假象钝的或污染的针尖产生假象：当针尖污染或有磨损时，所获图像有时是针尖的磨：当针尖污
21、染或有磨损时，所获图像有时是针尖的磨损形状或污染物的形状这种假象的特征是整幅图像都有同样的特征。损形状或污染物的形状这种假象的特征是整幅图像都有同样的特征。AFMAFM假象假象 3.双针尖或多针尖假象双针尖或多针尖假象：这种假象是由于一个探针末端带有两个或多个尖点所：这种假象是由于一个探针末端带有两个或多个尖点所致当扫描样品时，多个针尖依次扫描样品而得到重复图像。致当扫描样品时，多个针尖依次扫描样品而得到重复图像。AFMAFM假象假象 4.样品上污物引起的假象样品上污物引起的假象：当样品上的污物与基底吸附不牢时，污物可能被正在：当样品上的污物与基底吸附不牢时，污物可能被正在扫描的针尖带走并随针
22、尖运动，致使大面积图像模糊不清。扫描的针尖带走并随针尖运动，致使大面积图像模糊不清。AFMAFM假象假象 5.样品样品-针尖间的作用力太小针尖间的作用力太小：探针不能顺利地扫描样品而出现横向拉伸现象。此：探针不能顺利地扫描样品而出现横向拉伸现象。此时可以通过调节振幅衰减量来调节作用力。时可以通过调节振幅衰减量来调节作用力。AFMAFM假象假象在核酸研究中的应用在核酸研究中的应用 （1 1）对）对DNADNA分子的成像及其自组装研究分子的成像及其自组装研究 1992年，年，Bustamante等利用等利用AFM得到分得到分辨率达分子级水平的可重复质粒辨率达分子级水平的可重复质粒DNA图像，图像，
23、并可估算分子宽度和高度，这是原子力显并可估算分子宽度和高度，这是原子力显微镜微镜研究生物大分子研究生物大分子的一项重大突破。的一项重大突破。（2）AFM不仅可以研究整个复合物分子不仅可以研究整个复合物分子立体结构立体结构和和空间构象空间构象，同时还可以利，同时还可以利用某些特殊抗体蛋白或用某些特殊抗体蛋白或RNA分子在缓冲体系中与分子在缓冲体系中与DNA 相互作用过程中重要结相互作用过程中重要结构参数变化来探究构参数变化来探究DNA区域区域分子构型分子构型，这是，这是DNA研究的一个热点。研究的一个热点。（3）利用利用AFM可以可以控制控制生物大分子，生物大分子，调整生命的遗传与死亡规律调整生
24、命的遗传与死亡规律，也可以在，也可以在纳米尺度内将染色体的单拷贝基因复制扩增，切割剔除异常的碱基对，引起纳米尺度内将染色体的单拷贝基因复制扩增，切割剔除异常的碱基对，引起病理变化的逆转。病理变化的逆转。在核酸研究中的应用在核酸研究中的应用 在蛋白质研究中的应用在蛋白质研究中的应用 在蛋白质单分子在蛋白质单分子外形外形上的应用上的应用 如在质子泵和离子泵研究上的应用；在与光合作用相关蛋白质研究方面的应用等。在蛋白质在蛋白质表面物理特性表面物理特性研究上的应用研究上的应用 如对蛋白质表面的粘弹性的研究；蛋白质静电特性的测量。对蛋白质结构的研究对蛋白质结构的研究 如对蛋白质的抗体标记或酶消化的鉴定；
25、多肽末端移除的鉴定和多肽环置换或移出的鉴定等。在蛋白质的在蛋白质的功能功能特性方面的应用特性方面的应用 例如，Daniel等应用AFM在纳米分辨率上显示了膜蛋白的时间依赖性构象变化及聚集运动，成为经典的研究方法。对蛋白质对蛋白质单分子单分子操纵操纵 人们通过AFM操纵可以直接检测到该结构域的力学稳定性。AFM 成像与操纵的联合使其能够宏观地从单分子尺度上对生物系统进行精确和可控的修饰和研究。在蛋白质研究中的应用在蛋白质研究中的应用活细胞与微生物结构动态研究中应用活细胞与微生物结构动态研究中应用(1)(1)细胞或各种微生物细胞或各种微生物表面结构表面结构成像成像 AFM 现已广泛用于观察各种细胞
26、的表面结构，如血红细胞、神经细胞、上皮细胞等。(2)(2)对对细胞间细胞间的相互作用进行观察的相互作用进行观察 例如可研究动物胚胎移植中细胞的免疫排斥反应，病变细胞与健康细胞间的相互作用等。(3)识别正常细胞和癌细胞识别正常细胞和癌细胞 AFM会赋予一个表明细胞柔软度的数值。研究人员发现，尽管正常细胞的硬度各有不同，但癌细胞比正常细胞要柔软得多。AFMAFM与其他技术联用与其他技术联用（1）AFM与其他显微镜技术的联用与其他显微镜技术的联用 AFM与荧光共聚焦显微术结合对细胞膜功能域拓扑形态的研究 AFM和全内反射荧光显微镜联用进行单细胞的纳米操纵 AFM与光学显微镜和电镜的联用（2）AFM与
27、计算机模拟技术相结合，研究蛋白质晶体的空间结构与计算机模拟技术相结合，研究蛋白质晶体的空间结构（3）AFM单分子力谱线技术和蛋白质工程技术联用，研究力对巯单分子力谱线技术和蛋白质工程技术联用，研究力对巯基二硫键转换的动力学基二硫键转换的动力学（4）AFM可与可与PCR技术结合对技术结合对DNA进行扩增和修复进行扩增和修复（5）AFM与电化学技术的联用与电化学技术的联用（6）AFM与质谱技术联用与质谱技术联用 AFMAFM的特点的特点优点：优点：1.AFM 1.AFM 技术的样品制备简单，甚至无需处理，对样品破坏性较其他生物学常用技术的样品制备简单，甚至无需处理，对样品破坏性较其他生物学常用技术
28、技术(如电子显微镜如电子显微镜)要小得多。要小得多。2.AFM2.AFM能在多种环境能在多种环境(包括空气、液体和真空包括空气、液体和真空)中运作，生物分子可在其生理条中运作，生物分子可在其生理条件下直接成像，还能对活细胞进行实时动态观察。件下直接成像，还能对活细胞进行实时动态观察。3.AFM3.AFM能提供生物分子和生物表面的分子亚分子高分辨率的三维图像。能提供生物分子和生物表面的分子亚分子高分辨率的三维图像。4.AFM 4.AFM 也能以纳米尺度的分辨率观察局部的电荷密度和物理特性，测量生物大也能以纳米尺度的分辨率观察局部的电荷密度和物理特性，测量生物大分子间分子间(如受体和配体如受体和配体)的相互作用力。的相互作用力。5.AFM5.AFM能对单个生物分子进行操纵，如可搬动原子、切割染色体、在细胞膜上能对单个生物分子进行操纵，如可搬动原子、切割染色体、在细胞膜上打空。打空。AFMAFM的特点的特点缺点缺点：成像范围太小，速度慢，受探针的影响太大。成像范围太小，速度慢，受探针的影响太大。AFMAFM的特点的特点 Thank you
