1、食品生物技术导论目 录第一章第一章 绪绪 论论第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程第三章第三章 食品与蛋白质工程食品与蛋白质工程第四章第四章 食品与酶工程食品与酶工程第五章第五章 食品与发酵工程食品与发酵工程第六章第六章 食品与细胞工程食品与细胞工程第七章第七章 食品生物工程中的下游过程食品生物工程中的下游过程第八章第八章 食品生物技术与食品安全检测食品生物技术与食品安全检测第九章第九章 生物技术与食品工业生物技术与食品工业“三废三废”治理治理第一章第一章 绪绪 论论第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义第二节第二节 食品生物技术研究内容食品生物技术研究内容第三节第三节 食品生物
2、技术特点食品生物技术特点第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史第五节第五节 分子生物学的形成和发展分子生物学的形成和发展第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义一、生物技术一、生物技术l所谓生物工程是达到特殊目的生物过程的控制性工程所谓生物工程是达到特殊目的生物过程的控制性工程 “操纵生操纵生物物 （微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成（微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成及分解转化及分解转化”。二、食品生物技术二、食品生物技术l食品生物技术（食品生物技术（food biotechnologyfood biotechnology）是利用生物体及
3、其细胞、）是利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加工处理或制造食品产品的新技术。工处理或制造食品产品的新技术。第二节 食品生物技术研究内容一、食品与基因工程一、食品与基因工程l基因工程又称遗传工程，它是在体外将异源基因工程又称遗传工程，它是在体外将异源DNADNA（目的基因）与基因（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。二、食品与酶工程二、食品与酶工程l酶是活细胞产生的具高度催化活性和高度专一性的生物催化剂。酶是
4、活细胞产生的具高度催化活性和高度专一性的生物催化剂。l所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应的生物催所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应的生物催化工程，包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。化工程，包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。l酶工程的应用能有效地改造传统的食品工业。酶工程的应用能有效地改造传统的食品工业。三、食品与发酵工程三、食品与发酵工程发酵工程其涵义是采用现代发酵设备，使经基因重组技术改良的细胞发酵工程其涵义是采用现代发酵设备，使经基因重组技术改良的细胞或经其它现代技术改造的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化或经其它现代技术改造
5、的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化生产预定的食品产品或食品的功能成分。生产预定的食品产品或食品的功能成分。四、食品与细胞工程四、食品与细胞工程l应用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质应用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质和细胞培养技术，包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物和细胞培养技术，包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。l细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工控制条件下在生物反应器中细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工
6、控制条件下在生物反应器中大规模培养，获得人类所需要的各种食品产品及保健产品大规模培养，获得人类所需要的各种食品产品及保健产品 五、食品与蛋白质工程五、食品与蛋白质工程19831983年美国年美国Genex Genex 公司公司KUtrnerKUtrner提出蛋白质工程（提出蛋白质工程（protein protein engineeringengineering）概念，其涵义是指从蛋白质分子结构的设计入手，将待）概念，其涵义是指从蛋白质分子结构的设计入手，将待改进的蛋白质提纯为结晶，用改进的蛋白质提纯为结晶，用x x射线衍射等手段研究其空间构象，确定射线衍射等手段研究其空间构象，确定其需要改变的
7、氨基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方其需要改变的氨基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方法达到修饰蛋白质分子空间结构的目的。法达到修饰蛋白质分子空间结构的目的。六、食品与后基因组学六、食品与后基因组学l20032003年随着人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（年随着人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（post-post-genomicsgenomics）的诞生拉开了序幕。而现代研究认为，一个基因可以编码数）的诞生拉开了序幕。而现代研究认为，一个基因可以编码数个蛋白质，随之形成所谓基因组学（个蛋白质，随之形成所谓基因组学（genomicsgenomics）和蛋
8、白质组学）和蛋白质组学（proteomicsproteomics），近年来，在日本、美国和德国等国又启动了营养基因），近年来，在日本、美国和德国等国又启动了营养基因组学（组学（nutrigenomicsnutrigenomics）的研究。）的研究。七、食品与食品安全七、食品与食品安全生物技术的发展为食品安全的检测提供高速高效的生物技术的发展为食品安全的检测提供高速高效的PCRPCR系统检测技术。系统检测技术。为加强食品安全在食品加工过程除必须严格执行为加强食品安全在食品加工过程除必须严格执行CACCAC、HACCPHACCP、GMPGMP和和ACPACP安全体系外。还必须制订切实可行的食品安全
9、监督管理体系。安全体系外。还必须制订切实可行的食品安全监督管理体系。第三节第三节 食品生物技术特点食品生物技术特点一、食品生物技术与食品产业化紧密相关一、食品生物技术与食品产业化紧密相关l食品生物技术对改造传统食品工食品生物技术对改造传统食品工业和农副产品深加工，具有革命业和农副产品深加工，具有革命性意义和较大的经济价值。食品性意义和较大的经济价值。食品生物技术即食品生物工程包括上生物技术即食品生物工程包括上游工程（游工程（up stream processup stream process）和）和下 游 工 程（下 游 工 程（d o w n s t r e a m d o w n s t
10、r e a m processprocess），整个过程有多个操作），整个过程有多个操作工序，一环扣一环，核心技术为工序，一环扣一环，核心技术为生物技术和酶工程，形成较为完生物技术和酶工程，形成较为完整的产业链，如图整的产业链，如图1-11-1所示。所示。图图1-1 1-1 食品生物技术产业链示意图食品生物技术产业链示意图二、食品生物技术属边缘性交叉学科二、食品生物技术属边缘性交叉学科生物技术是研究生命的科学技术，是生物科学和工程学综合交叉的边生物技术是研究生命的科学技术，是生物科学和工程学综合交叉的边缘学科。缘学科。三、食品生物技术具有三、食品生物技术具有“六高六高”基本特征基本特征l食品生
11、物技术与其他高新技术一样，对国民经济的发展和食品工业的食品生物技术与其他高新技术一样，对国民经济的发展和食品工业的革新具有革新具有“六高六高”的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高竞争、的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高竞争、高风险和高潜力。高风险和高潜力。四、食品生物技术属高新技术范畴四、食品生物技术属高新技术范畴l根据当今世界科技发展对世界经济发展贡献情况。信息、能源、生物根据当今世界科技发展对世界经济发展贡献情况。信息、能源、生物技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界“七大七大”高科技领域。高科技领域。五、食品生物技术已成为食品科学发
12、展的重要研究方向五、食品生物技术已成为食品科学发展的重要研究方向食品生物技术作为生物技术的分支学科，在自然科学中涵盖范围广为食品生物技术作为生物技术的分支学科，在自然科学中涵盖范围广为其特征。其特征。第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史一、史前时期一、史前时期l从出土文物发现，追溯至距今数千多年前的龙山文化时期。酿酒、制从出土文物发现，追溯至距今数千多年前的龙山文化时期。酿酒、制醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。二、近代时期二、近代时期从从1919世纪世纪5050年代开始，伴随着欧洲的文艺复兴带来科学和工业的繁荣。年代开始，伴
13、随着欧洲的文艺复兴带来科学和工业的繁荣。由于法国科学家巴斯德（由于法国科学家巴斯德（PasteurPasteur）对微生物学创立的贡献，德国科）对微生物学创立的贡献，德国科学家柯赫（学家柯赫（KochKoch）发明了微生物的分离和纯种培养技术和法国学者布）发明了微生物的分离和纯种培养技术和法国学者布合乃尔（合乃尔（BuchnerBuchner）兄弟俩通过实验揭示了发酵本质是细胞中酶的作）兄弟俩通过实验揭示了发酵本质是细胞中酶的作用。标志着传统食品生物技术向近代食品生物技术的发展。从传统发用。标志着传统食品生物技术向近代食品生物技术的发展。从传统发酵食品的生产靠天然微生物作用酵食品的生产靠天然微
14、生物作用 。三、现代的发展三、现代的发展l从从2020世纪世纪5050年代初开始，伴随着生物化学，遗传学和化学分析技术的年代初开始，伴随着生物化学，遗传学和化学分析技术的发展。特别是发展。特别是19531953年年“DNADNA双螺旋结构双螺旋结构”的发现、的发现、19691969年酶固定化技年酶固定化技术的应用成果和术的应用成果和19731973年基因工程诞生等重大科技成就为标志的划时代年基因工程诞生等重大科技成就为标志的划时代发展发展 第五节第五节 分子生物学的形成和发展分子生物学的形成和发展一、细胞学说一、细胞学说l在在1919世纪中时施莱登和施旺（世纪中时施莱登和施旺（SchwannS
15、chwann）两位学者经过）两位学者经过2020年的研究绘年的研究绘出有关细胞结构明显图象和细胞组成，从而创立了细胞学说。出有关细胞结构明显图象和细胞组成，从而创立了细胞学说。二、生物进化论二、生物进化论l奥地利学者格里哥尔奥地利学者格里哥尔.孟德尔（孟德尔（Gregor MendelGregor Mendel）研究认为，遗传性状）研究认为，遗传性状是由一对遗传因子决定的，是由一对遗传因子决定的，四、摩尔根的基因学说四、摩尔根的基因学说摩尔根提出：摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因叫做遗传
16、因子，或者更简单地叫做基因”。五、基因本质的发现五、基因本质的发现l摩尔根提出：摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。多年来研究证实这种转化。多年来研究证实这种转化物质就是物质就是DNADNA，这是基因本质的重大发现。，这是基因本质的重大发现。六、分子生物学的诞生六、分子生物学的诞生19531953年美国遗传学家詹姆斯年美国遗传学家詹姆斯.沃森（沃森（James D.WatsonJames D.Watson）和英国生物物理学家弗朗西斯）和英国生物物理学家弗
17、朗西斯.克里克克里克（Francis crickFrancis crick）根据莫）根据莫.休休.弗弗.威尔金斯（威尔金斯（M.H.F.wilkinsM.H.F.wilkins）的）的x-x-射线衍射等系列图谱结射线衍射等系列图谱结构分析基础上，用标度分子模型在英国构分析基础上，用标度分子模型在英国Max PerutzMax Perutz教授分子生物学实验室进行研究。其研究教授分子生物学实验室进行研究。其研究成果，在英国成果，在英国自然自然杂志上发表的杂志上发表的DNADNA结构结构一文，提出了一文，提出了“DNADNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型”。首。首次阐明了次阐明了D D结构与功能，为
18、遗传信息的贮存、传递和利用提供了科学依据，创立了现代分结构与功能，为遗传信息的贮存、传递和利用提供了科学依据，创立了现代分子生物学。这是子生物学。这是2020世纪科学史上划时代的里程碑。世纪科学史上划时代的里程碑。WatsonWatson和和crickcrick均为诺贝尔奖获得者。均为诺贝尔奖获得者。DNADNA双螺旋结构分子模型如图双螺旋结构分子模型如图1-11-1、1-21-2所示其结构要点说明如下：所示其结构要点说明如下：图图1-1 DNA1-1 DNA分子双螺旋结构模型分子双螺旋结构模型图图1-2 DNA1-2 DNA双螺旋结构分子模型双螺旋结构分子模型 （1 1）DNADNA是由两条
19、极性相反并互补的多聚核苷酸链，围绕中心轴的双是由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链，围绕中心轴的双螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。（2 2）两条链中碱基之间按照）两条链中碱基之间按照A A配对配对T T、G G配对配对C C的互补原则，的互补原则，DNADNA两链间两链间的维系主要靠氢键，其中的维系主要靠氢键，其中A A与与T T之间形成二个氢键，之间形成二个氢键，G G与与C C之间形成三个之间形成三个氢键。氢键。（3 3）双螺旋的直径为）双螺旋的直径为2nm2nm，两个相邻碱基的间距为，两个相邻碱基的间距为0.34nm0.34nm，每，
20、每1010个碱个碱基的间距为基的间距为3.4nm3.4nm，构成一段完整的螺旋结构，其相邻碱基的夹角为，构成一段完整的螺旋结构，其相邻碱基的夹角为3636。（4 4）两条多聚核苷酸链间碱基配对的互补规律为：）两条多聚核苷酸链间碱基配对的互补规律为：A A配对配对T T或或T T配对配对A A、G G配对配对C C或或C C配对配对G G，而且其分子比率为，而且其分子比率为1 1。（1 1）DNADNA分子能自我复制根据分子能自我复制根据DNADNA双双螺结构模型，在两条多聚核苷酸链螺结构模型，在两条多聚核苷酸链中，任何一条都可以作为另一条生中，任何一条都可以作为另一条生物合成的模板，这一点明显
21、地不同物合成的模板，这一点明显地不同于其它生物大分子。经过自我复制于其它生物大分子。经过自我复制出来的每一个出来的每一个DNADNA分子中的一条链被分子中的一条链被保留下来。这种复制，称为半保留保留下来。这种复制，称为半保留复 制（复 制（S e m i c o n s e r v a t i v e S e m i c o n s e r v a t i v e replicationreplication）（如图）（如图1-31-3）。）。（2 2）DNADNA是遗传基因的载体是遗传基因的载体 可以从分子水平上阐明其生物学功能：可以从分子水平上阐明其生物学功能：图图1-3 1-3 半保留复
22、制示意图半保留复制示意图（3 3）DNADNA双螺旋结构模型为遗传双螺旋结构模型为遗传信息的保存、传递和利用提供了信息的保存、传递和利用提供了基础。同时，根据基础。同时，根据19701970年年CrickCrick等等人提出的分子生物学中心法则，人提出的分子生物学中心法则，如图如图1-41-4所示。所示。（4 4）DNADNA的调节功能的调节功能19611961年，法年，法国 分 子 生 物 学 家国 分 子 生 物 学 家 F.J a c o bF.J a c o b 和和J.MonodJ.Monod首次证实在大肠杆菌（）首次证实在大肠杆菌（）基因调节事实，提出了乳糖操纵基因调节事实，提出了
23、乳糖操纵子（子（Lac OperonLac Operon）假说。）假说。图图1-4 1-4 分子生物学中心法则分子生物学中心法则55l应用乳糖操纵子假说，从分子水平上阐明基因控制蛋白质的诱导合成应用乳糖操纵子假说，从分子水平上阐明基因控制蛋白质的诱导合成另一种酶合成调节与酶的诱导合成机制不同，称为酶的反馈阻遏。另一种酶合成调节与酶的诱导合成机制不同，称为酶的反馈阻遏。第一节第一节 概概 述述 第二节第二节 工具酶工具酶 第三节第三节 目的基因制备目的基因制备 第四节第四节 基因载体基因载体 第五节第五节 基因重组基因重组 第六节第六节 转化、增殖和表达转化、增殖和表达 第七节第七节 基因工程在
24、食品工业中应用基因工程在食品工业中应用 第八节第八节 后基因组学及其应用研究后基因组学及其应用研究第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程第一节第一节 概概 述述一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生l19731973年年S.N.CohenS.N.Cohen等在美国科学院学报（等在美国科学院学报（PNASPNAS）上发表了题为）上发表了题为“Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”Vitr
25、o”，阐明了体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志，阐明了体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志着基因工程的诞生着基因工程的诞生 二、基因工程涵义、特点及其操作步骤二、基因工程涵义、特点及其操作步骤基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）又）又称为分子克隆（称为分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）或重组或重组DNADNA技术（技术（recombinant DNA recombinant DNA TechnologyTechnology），其涵义为：用酶学），其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载
26、体方法，将异源基因与载体DNADNA在体外在体外进行重组，将形成的重组子进行重组，将形成的重组子DNADNA导入导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要种或性状，大量生产出人类所需要生物品种和产物。生物品种和产物。基因工程操作过程如图基因工程操作过程如图2-12-1所示。所示。图图2-12-1基因工程操作过程示意图基因工程操作过程示意图22三、基因工程的发展三、基因工程的发展19771977年英国分子生物学家年英国分子生物学家F.SangerF.Sanger发明了快速发明了快速DN
27、ADNA测序技术并首先完测序技术并首先完成的全长成的全长5387bp5387bp的的174174噬菌体基因组全序列的测定噬菌体基因组全序列的测定 。19821982年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使用。用。19831983年第一个转基因植物培育成功，年第一个转基因植物培育成功，19921992年第一个转基因玉米及转基年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，因小麦植株诞生，19941994年转基因番茄上市。年转基因番茄上市。19961996年完成了酵母基因组年完成了酵母基因组DNADNA（125125105bp105b
28、p）的全序列测定。）的全序列测定。20032003年年人类基因组计划人类基因组计划经过经过2020多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序幕幕 。第二节第二节 工具酶工具酶在基因工程中应用的酶统称为工具酶（在基因工程中应用的酶统称为工具酶（enzyme of toolsenzyme of tools）。）。l一、限制性内切酶种类一、限制性内切酶种类l限制性内切酶有三种类型：限制性内切酶有三种类型：I I型酶、型酶、IIII型酶和型酶和IIIIII型酶。型酶。lIIII型酶分子量较小，大约型酶分子量较小，大约20-100kD
29、20-100kD，是一种简单的单功能酶，作用时，是一种简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需无需辅助因子或只需Mg2+Mg2+，能识别双链，能识别双链DNADNA上特异的核苷酸序列，同上特异的核苷酸序列，同时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合于时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合于基因工程操作。基因工程操作。l二、限制性内切酶命名二、限制性内切酶命名l19731973年，年，H.O.SmithH.O.Smith和和NathausNathaus提出限制性内切酶的命名原则提出限制性内切酶的命名原则 一、限制性内切酶一、限制性内切酶l限制性内切酶（限制性
30、内切酶（restriction endonuclease restriction endonuclease 简称简称RERE）是一类专一性）是一类专一性很强的核酸内切酶很强的核酸内切酶 l三、限制性内切酶的作用机制和作用方式三、限制性内切酶的作用机制和作用方式如图如图2-22-2所示所示图图2-22-2限制性核酸内切酶作用机制限制性核酸内切酶作用机制 l其作用方式及识别位点有如下几种：其作用方式及识别位点有如下几种：l1.1.识别不同的特异核苷酸序列识别不同的特异核苷酸序列lEcoR IEcoR I识别识别lHae IHae I识别识别 53GAATTC 5()()3 ATGGCCTAAsu
31、IAsu I识别识别 EcoR IIEcoR II识别识别Mbo IMbo I识别识别 注：注：表示切割表示切割5-5-磷酸二酯键位置。磷酸二酯键位置。2.2.识别序列皆具有回文结构识别序列皆具有回文结构3.3.切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分两种：粘性末端和平整末端。两种：粘性末端和平整末端。53 GGACC5()3 ACCGGT53 GATC5335GGATCCGGATCCCCTAGGGGATCC正读时为反读时为l限制性内切酶错位切割限制性内切酶错位切割DNADNA双链而形成彼此互补的单链末端，称为双链而形成彼
32、此互补的单链末端，称为粘性末端（粘性末端（Cohesion endsCohesion ends）。）。另一种是在同一位点平齐切割另一种是在同一位点平齐切割DNADNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端（两条链而形成的双链末端，称为平整末端（Flush Flush endsends）。如）。如Alu IAlu I的识别序列为：的识别序列为：l4.4.切割后形成异源二聚体切割后形成异源二聚体l四、限制性内切酶识别序列及反应系统四、限制性内切酶识别序列及反应系统l限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNADNA上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。
33、l稀切酶（稀切酶（rare cuting enzymesrare cuting enzymes），如表），如表2-12-1所示所示 ，同裂酶（，同裂酶（isoschizomerisoschizomer）如表）如表2-22-2所示。同尾酶（所示。同尾酶（isocaudamerisocaudamer），如表），如表2-32-3所示。所示。表表2-1 2-1 部分限制性内切稀切酶部分限制性内切稀切酶22稀切酶切 割 位 点 数识别序列Ad2SV40X174M13mp7PBr322T7TPAA.DFseIGGCCGGCCO30000001NotIGCGGCCGC070000000RsrIICGGWCC
34、G520000110SfiIGGCCN5CCGG031000112SgrICrCCGGyG760001000SwaIATTT/AAAT011010101表表2-2 2-2 具有相同切割位点的同裂酶具有相同切割位点的同裂酶限制性核酸内切酶识别序列及切割位点限制性核酸内切酶识别序列及切割位点AatI，StuIAAGG/CCTBamHI，BstIG/GATCCAccII，FnuDII，MunI，ThaICG/CGBbnIII，ClaIBbuI，SphIAT/CGATGCATG/CAccIII，BspII，MroIT/CCGGABbrPI，PmaCICAC/GTGAcyI，AhaII，AnsII，Bb
35、iIIGr/CgyCBcnI，NciIBspRI，HaeIII，PatICC/sGGGG/CCAflI，AuaII，Eco471G/GwCCBstYI，MflI，XhoIIR/GATCyAflII，BfrIC/AATTGCcrI，PaeR71，XhoI，SexIC/TCGAGAhaIII，DraITTT/AAACelII，EspIGC/TnAGCAocI，Bsu361，Crnl,Eco811CC/TnAGGCfoI，HhaICfrI，EaeIGCG/CY/GGCCrAocII，BmyI，Bsp1286，NspII，SduIGdGCh/CDarII，EcoO1091EagI，EclXI，Eco5
36、21rG/GnnCCyC/GGCCGAosI，AuiII，PspITGC/GCAEcoT141，StyIC/CwwGGApaLI，SnoIG/TGCACEcoVIII，HindIIIA/AGCTTApyI，BstNI，MvaICC/wGGHapII，HpaII，MspIC/CGGAquI，AvaI，AvrI，NspIIIC/yCrGHincII，HindIIGty/rACAseI，AsnIAT/TAATKsPI，SacII，SstIICCGC/GGAsp7001，XmnIGAAnn/nnTTCNspHI，NsPIrCAtG/yAspHI，HgiAIGwGCw/GPvuI，XorIICGAT/C
37、GAspI，Tth111GACn/nnGTCSacI，SstIGAGCT/CAspI，Cfr131，NspIV，Sau961G/GnCCTaqI，TthHB81XamI，XcyIT/CGAC/CCGGGAsuII，BstBI，NspV，SfuITT/CGAA表表2-3 2-3 部分限制性核酸内切同尾酶部分限制性核酸内切同尾酶22黏性末端限 制 性 核 酸 内 切 酶5CATGAflIII，DsaI，NcoI，StyI，BspHI5GATCSau3A，NdeII，BglII，XhoII，BamHI，MleI，BelI5GGCCEclXI，EaeI5CGCGMluI，AflIII，BssHII，D
38、saI5CCGGCfr10，AgeI，XmaI，AvaI，MorI5TCGASaeI，XhoI，AvaI5GTACSap718，BanI，SphI5CTAGSpeI，NheI，AvrII，StyI，XbaI5CGMaeI，AcyI，HinPI，NarI，HpaII，MspI，TaqI，ClaI，AccI，SfuI5TANdeI，MaeI，MseI，AsnICATG3NlaIII，NspI，SphIAGCT3SacI，BanII，BmyIGGCC3ApaI，BanII，BmyI，AspHITGCA3NsiI，AspHI，BmyI，PstIGCGC3HaeII，BbeI二、基因工程操作中的其他酶二
39、、基因工程操作中的其他酶（一）、（一）、DNADNA连接酶连接酶（二）、（二）、DNADNA聚合酶聚合酶I I（三）、碱性磷酸酯酶（三）、碱性磷酸酯酶（四）、（四）、T4T4多聚核核苷酸激酶多聚核核苷酸激酶（五）、（五）、S1S1核酸酶核酸酶（六）、反向转录酶（六）、反向转录酶第三节第三节 目的基因制备目的基因制备原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两种方法。种方法。一、生物学方法一、生物学方法l原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（shotgun cloningshotgu
40、n cloning）来克）来克隆分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基隆分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基因，兼有外显子和内含子。因，兼有外显子和内含子。l另一种生物学方法是采用分子杂交手段。另一种生物学方法是采用分子杂交手段。19731973年年，ShinShin和和MartinMartin用分用分子杂交技术分离目的基因获得成功。子杂交技术分离目的基因获得成功。二、化学合成法二、化学合成法化学合成一个循环有如下化学合成一个循环有如下4 4个步骤：个步骤：l整个合成反应历程如图整个合成反应历程如图2-32-3表示。表示。图图2-3 2-3 固定化亚磷
41、酸三酯法合成寡聚核苷酸固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸三、基因文库法三、基因文库法基因文库（基因文库（gene librarygene library）或称为）或称为DNADNA文库，它是指用克隆方法将一文库，它是指用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。当需要种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。当需要重组体重组体DNADNA某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为cDNAcDNA文库文库3434。cDNAcDNA文库构建的步骤：文库构建的步骤：l1.1.酶促合成法制取酶促合成法制取cDNAc
42、DNAl2.2.从组织或细胞中制备总从组织或细胞中制备总RNARNA和和mRNAmRNAl3.3.合成合成cDNAcDNA第一条链第一条链l其反应过程为图其反应过程为图2-52-5的所示。的所示。图图2-5 2-5 合成合成cDNAcDNA第一链反应过程第一链反应过程l4.cDNA4.cDNA第二条链的合成，其反应历程如图第二条链的合成，其反应历程如图2-62-6所示。所示。图图2-6 2-6 置换法合成置换法合成cDNAcDNA反应过程反应过程四、四、PCRPCR扩增法扩增法19851985年，美国年，美国CetusCetus公司的公司的MullisMullis等人开发成功的聚合酶等人开发成
43、功的聚合酶链式反应（链式反应（Polymerase chain Polymerase chain reactionreaction，PCR PCR）技术，这一）技术，这一快速地扩增特异快速地扩增特异DNADNA片段系统片段系统在分子生物学领域中是一项重在分子生物学领域中是一项重大的革新。大的革新。其反应历程如图其反应历程如图2-72-7所示。所示。图图2-7 PCR2-7 PCR扩增技术基本原理扩增技术基本原理第四节第四节 基因载体基因载体目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体，它目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体，它们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符
44、合作为载体应具备的下列条们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备的下列条件：件：（1 1）本身是一个复制子，能自我复制；）本身是一个复制子，能自我复制；（2 2）相对分子质量较小，）相对分子质量较小，（3 3）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记 （4 4）只有单一限制性内切酶切点）只有单一限制性内切酶切点一、质一、质 粒粒l质粒（质粒（plasmidplasmid）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋共价闭环的共价闭环的DNADNA（covalently,closed and circ
45、ular DNA,covalently,closed and circular DNA,缩写为缩写为cccDNAcccDNA）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。（一）质粒载体（一）质粒载体pBR322pBR322pBR322pBR322是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图2-82-8所示所示55。用小写英文字母用小写英文字母P P代表质粒，代表质粒，BRBR表示该质粒表示该质粒 研究者研究者Bolivar Bolivar 和和RogigerusRogigerus，而，而322322是具体研究编号
46、。是具体研究编号。pBR322pBR322大小为大小为4363bp4363bp，（，（1bp=11bp=1碱基对）含有碱基对）含有2 2个抗生素抗性基因个抗生素抗性基因 。pBR322pBR322质粒具有抗菌素抗性基因质粒具有抗菌素抗性基因 ，构建的，构建的pBR325pBR325、pBR327pBR327如图如图2-92-9、图图2-102-10所示。所示。图图2-9 pBR3252-9 pBR325衍生质粒衍生质粒 图图2-10 pBR3272-10 pBR327衍生质粒衍生质粒（二）质粒载体（二）质粒载体PUCPUCpUCpUC质粒是在质粒是在pBR322pBR322的基础上，在的基础上
47、，在未端加入一段多克隆位点未端加入一段多克隆位点（multiple cloning sites,MCSmultiple cloning sites,MCS）的）的LacZLacZ基因。基因。二、二、噬菌体噬菌体l噬菌体（噬菌体（PhagePhage）是病毒的一种，形态微小，只能在电子显微镜下才）是病毒的一种，形态微小，只能在电子显微镜下才能观察到。能观察到。三、三、M M1313噬菌体噬菌体四、病毒四、病毒第五节第五节 基因重组基因重组基因重组即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重基因重组即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。组子。图图2-11 DNA2-11
48、 DNA体外重组方式体外重组方式 第六节第六节 转化、增殖和表达转化、增殖和表达一、转化一、转化1 1、宿主细胞、宿主细胞2 2、感受态、感受态3 3、扩增检筛、扩增检筛 R.K.Saiki R.K.Saiki和和K.B.MullisK.B.Mullis分别于分别于19851985年和年和19871987年发展了一年发展了一种种“多聚酶链反应（多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）”。PCRPCR技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变性处理，令其双股链解开
49、；进行反链杂交、退火、形成单链；用性处理，令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用Taq DNATaq DNA多聚酶沿多聚酶沿DNADNA链全程全成出两股双链链全程全成出两股双链DNADNA分子；然后开始第分子；然后开始第二个反应周期二个反应周期 。二、基因表达二、基因表达 克隆克隆DNADNA的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过DNADNA重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就必须使特点基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（或酶），增加，就必须使特点基因进一步转
50、录、翻译为相应的蛋白质（或酶），进而获得它们的代谢产物，这一过程进而获得它们的代谢产物，这一过程称称为基因表达。为基因表达。第七节第七节 基因工程在食品工业中应用基因工程在食品工业中应用一、转基因微生物食品一、转基因微生物食品转基因微生物菌株则称为工程菌（转基因微生物菌株则称为工程菌（engineering strainengineering strain）。）。（一）应用于提高食品产品的品质（一）应用于提高食品产品的品质第 一 个 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 为 面 包 酵 母第 一 个 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 为 面 包 酵 母（
