1、生物芯片检测细胞中microRNA 的表达MicroRNA Expression in Cells Detected by Oligonucleotide Microarray07生技生技1 microRNA(miRNA)是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小小RNA 分子分子,长度为长度为18-26 个核苷酸个核苷酸(nt)的小非编码的小非编码RNA，类似于，类似于siRNA的分子的分子。miRNA 通过调节基因表达通过调节基因表达,参与调控细胞的众多生物学功能参与调控细胞的众多生物学功能,如生如生物发育、脂肪代谢物发育、脂肪代谢,及细胞的分化
2、、增殖和凋亡等。它们通过与靶及细胞的分化、增殖和凋亡等。它们通过与靶mRNA 的的3 非翻译区非翻译区(3-UTR)互补互补,将将mRNA 剪切或是抑制其翻译。剪切或是抑制其翻译。人类基因组中已发现人类基因组中已发现300 多种多种miRNA,而且预测实际数目会更多而且预测实际数目会更多,它们可能它们可能会对人类基因组中近会对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用。但关于的基因发挥调控作用。但关于miRNA 的表达模式、生的表达模式、生物学功能、作用机制等物学功能、作用机制等,目前的认识还不很清楚。在此目前的认识还不很清楚。在此,我们设计并制备了我们设计并制备了miRNA 表达谱的寡核苷酸芯片
3、表达谱的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的检测特点利用其快速、平行、高通量的检测特点,分析分析了了6 种不同细胞系中种不同细胞系中206 个个miRNA 的表达水平特点的表达水平特点,为为miRNA 的进一步研究奠的进一步研究奠定了基础。定了基础。1 材料和方法材料和方法1.1 1.1 材料材料 实验所用实验所用6 种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存,分别分别HeLa(人人宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞人慢性髓细胞性白血病细胞)、ES-2(人人卵巢透明细胞癌卵巢透明细胞癌)、MCF-7(人乳腺癌细胞人乳腺癌细胞)、HT-2
4、9(人结肠腺癌人结肠腺癌细胞细胞)和和A549 细胞细胞(人肺腺癌细胞人肺腺癌细胞)。所有细胞系均在。所有细胞系均在5%CO2 条条件下件下,用含有用含有10%胎牛血清的适合培养基培养。胎牛血清的适合培养基培养。1.2 miRNA1.2 miRNA 芯片的制备芯片的制备 所用的所用的210 个寡核苷酸探针为个寡核苷酸探针为mirVanaTM miRNA Probe Set试试剂盒剂盒(Ambion),其中其中206 个与已知的人类和小鼠个与已知的人类和小鼠miRNA 序列互补序列互补,4 个为阳性对照。个为阳性对照。3SSC 点样缓冲液溶解探针至点样缓冲液溶解探针至50 mol/L,用用Spo
5、tArrayTM 24 基因芯片点样仪基因芯片点样仪(Perkin Elmer)印制于印制于SuperChipTM(PerkinElmer)玻片表面玻片表面,制成制成miRNA 寡核苷酸芯寡核苷酸芯片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理。1.3 miRNA1.3 miRNA 的准备、标记与杂交的准备、标记与杂交 依依mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion)说明书提取肿瘤说明书提取肿瘤细胞的富集细胞的富集miRNA。用。用Universal Microplate Spectrophotometer(Bio-tek)紫外分
6、析仪测定紫外分析仪测定miRNA 浓度和纯度浓度和纯度,8 mol/L 尿素变性的尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依mirVanaTMmiRNALabeling Kit(Ambion)说明书对富集说明书对富集miRNA 进进行荧光标记行荧光标记,方法简单描述如下方法简单描述如下:先在先在miRNA 末端添加末端添加20-50 个经个经过氨基修饰的核苷酸尾过氨基修饰的核苷酸尾,然后与带有然后与带有N-羟基琥珀酰亚胺酯类羟基琥珀酰亚胺酯类(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的荧光染料的荧光染料Cy3(Amersham Bios
7、ciences)反应。标记后的样本与反应。标记后的样本与3miRNA Hybridization Buffer(Ambion)混合并将其均匀铺于混合并将其均匀铺于miRNA 寡核寡核苷酸芯片表面苷酸芯片表面,小心加盖玻片封片小心加盖玻片封片,置于密封湿润的杂交仓中置于密封湿润的杂交仓中,42杂交杂交16 h。最后进行杂交后清洗。最后进行杂交后清洗。1.4 1.4 芯片图像的采集与数据处理芯片图像的采集与数据处理 采用采用ScanArrayTM Express1.0(Perkin Elmer)扫描扫描仪进行扫描仪进行扫描,扫描强度为扫描强度为100%,光电倍增管增益为光电倍增管增益为80%,扫描
8、精度为扫描精度为10m。扫描所得图。扫描所得图ScanArray3.0(Perkin Elmer)软件进行处理软件进行处理,得到杂交信号和与之相应背景的得到杂交信号和与之相应背景的平均强度值平均强度值,从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强度值。度值。6 种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。判断表达存在差异的标准是判断表达存在差异的标准是:相互比较的相互比较的miRNA 信号信号荧光强度值相差至少大于荧光强度值相差至少大于1 000;若其中有信号强度值若其中有信号强度值小于小于100,则同一种则同一种miRNA
9、在不同细胞的荧光值差异需在不同细胞的荧光值差异需大于大于500。数据经总体归一化和对数转化后。数据经总体归一化和对数转化后,Cluster3.0(Stanford University)进行聚类分析。进行聚类分析。1.5 RT-PCR 1.5 RT-PCR 验证验证miRNAmiRNA 分别取分别取6 种细胞总种细胞总RNA 各各5 g,用与用与miR-17-5p、miR-21前体互补的特异性引物和逆转录酶前体互补的特异性引物和逆转录酶Superscript(Invitrogen)进行逆转录反应进行逆转录反应,分别分别取取1 L 逆转录产物进行逆转录产物进行PCR 反应中的反应中的miRNA
10、序列序列设计特异性引物设计特异性引物,有关参数见表有关参数见表1。用。用15%非变性聚非变性聚丙烯酰胺凝胶验证扩增产物大小丙烯酰胺凝胶验证扩增产物大小;用用LabWorks4.0 ImageAcquisition and Analysis 软件进行定量及软件进行定量及数据处理。取数据处理。取PCR 产物连入产物连入pGEM-T-easy 载体载体(Promega),送交测序送交测序,测序结果与提供的测序结果与提供的miRNA 序列一致。序列一致。2 结果结果2.1 miRNA2.1 miRNA 的抽提和纯化的抽提和纯化 6 种细胞系富集种细胞系富集miRNA 的的D260nm/D280nm 值
11、均为值均为1.82.1,符合符合miRNA 芯片的检测要求。芯片的检测要求。2.2 2.2 芯片杂交结果芯片杂交结果 标记、纯化后的标记、纯化后的miRNA 与芯片杂交与芯片杂交,用扫描仪在用扫描仪在543 nm 通道处通道处对芯片进行扫描对芯片进行扫描,得到图像得到图像,用用Scanarray3.0 软件分析软件分析miRNA在在6 种种细胞中的表达水平。经比较发现细胞中的表达水平。经比较发现,91 个个miRNA 在在6 种细胞间没有明显种细胞间没有明显差异差异,115 个个miRNA 存在差异。存在差异。miR-21 在在6 种细胞中校正信号强度种细胞中校正信号强度/背景强度均大于背景强
12、度均大于2 倍倍,表达水平均较高表达水平均较高;miR-17-5p 和和miR-20a 在在6 种细胞中的表达情况相似种细胞中的表达情况相似,在在ES-2细胞中校正信号强度细胞中校正信号强度/背景强度大于背景强度大于10 倍倍,表达较高表达较高;miR-126与与miR-128a 和和miR-151,miR-145 与与miR-297-1 在在HeLa 和和MCF-7 细胞中的表达水平类似。见表细胞中的表达水平类似。见表2。2.3 数据聚类分析数据聚类分析将扫描得到的杂交后图像用将扫描得到的杂交后图像用ScanArray3.0 软件进行软件进行处理处理,所得数据经归一化和对数转换后所得数据经归
13、一化和对数转换后,用用Cluster3.0 进行聚类分析。结果进行聚类分析。结果,MCF-7 和和HeLa 细胞细胞miRNA 的表达谱聚为一类。的表达谱聚为一类。2.4 RT-PCR 2.4 RT-PCR 检测检测用特异性引物对用特异性引物对miR-17-5p、miR-21 前体进行扩增前体进行扩增,同时以同时以U6 作为内参。各细胞中作为内参。各细胞中miRNA 前体的表达水前体的表达水平经内参校正后平经内参校正后,发现发现miR-17-5p 前体在前体在K562 细胞细胞中的表达水平最高中的表达水平最高,在在ES-2 细胞中的表达量次之细胞中的表达量次之;miR-21 在在6 种肿瘤细胞
14、中的表达水种肿瘤细胞中的表达水平均较高平均较高,与芯片检测结果基本一致与芯片检测结果基本一致(图图1)。图一图一3 3 讨论讨论 microRNA 是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA 分子分子,它们通过与靶它们通过与靶mRNA 的的3 非翻译区非翻译区(3-UTR)互补互补,将将mRNA 剪切或是抑制其翻译。已很明确剪切或是抑制其翻译。已很明确,miRNA 在调控基因表达过程在调控基因表达过程中发挥非常重要的作用中发挥非常重要的作用,而理解而理解miRNA 在生物体内如何发挥作用的关在生物体内如何发挥作用的关键是要知道键是要知道miR
15、NA 的表达模式。但是因为的表达模式。但是因为miRNA 的长度非常短的长度非常短(只只有有18-26 nt),检测检测miRNA 的方法受到很大的限制。我们利用生物芯的方法受到很大的限制。我们利用生物芯片的高通量、高敏感性的特点片的高通量、高敏感性的特点,为在组织和细胞中检测多种为在组织和细胞中检测多种miRNA 提提供了理想的手段。供了理想的手段。实验中用荧光标记的实验中用荧光标记的miRNA 直接与直接与miRNA 检测芯片杂交检测芯片杂交,检测发现检测发现6种细胞系有各自不同的种细胞系有各自不同的miRNA 表达谱。实验检测到表达谱。实验检测到miR-21 在在6 种肿瘤种肿瘤细胞中的
16、表达水平均较高细胞中的表达水平均较高,这与文献报道的这与文献报道的miR-21 在在70%的肺癌和的肺癌和70%的结直肠癌患者中表达上调一致的结直肠癌患者中表达上调一致6。Iorio 等等7也发现也发现,miR-21 在乳腺在乳腺癌中表达明显上调癌中表达明显上调,而且在一定程度上可以显示肿瘤的恶性程度。而且在一定程度上可以显示肿瘤的恶性程度。miRNA 集簇存在是其一个显著特征集簇存在是其一个显著特征,我们检测到我们检测到miR-17-5p 与与miR-20a的表达的表达水平类似水平类似,而也有文献报道而也有文献报道miR-17-5p 与与miR-20a 及其他及其他4 种种miRNA 成集簇
17、存在于人类第成集簇存在于人类第13 号染色体上号染色体上8。ODonnell等等9通过染色质免疫通过染色质免疫沉淀实验沉淀实验,发现发现c-Myc 可直接与可直接与miR-17-5p集簇位点结合集簇位点结合,激活其表达激活其表达,提示这一提示这一miRNA 的表达可能和肿瘤的发生存在某种关联。的表达可能和肿瘤的发生存在某种关联。MCF-7 和和HeLa 分别来源于人类乳腺和宫颈分别来源于人类乳腺和宫颈,它们发育起源类似它们发育起源类似,共同起源于胚胎内共同起源于胚胎内胚层。我们检测到胚层。我们检测到MCF-7 和和HeLa 细胞细胞miRNA 的表达谱聚为一类。提示的表达谱聚为一类。提示在哺乳
18、动物体内特殊的在哺乳动物体内特殊的miRNA 有可能参与维持胚胎早期发生过程中的多有可能参与维持胚胎早期发生过程中的多潜能细胞状态潜能细胞状态10,在器官和组织的发育、形成中发挥重要调控作用。在器官和组织的发育、形成中发挥重要调控作用。总总RNA 中中miRNA 所占的比例极少所占的比例极少(约为约为0.01%)11,为了验证芯为了验证芯片检测结果是否可以反映片检测结果是否可以反映miRNA 在总在总RNA 中的量中的量,我们用我们用RT-PCR 的方的方法对芯片检测结果进行了验证。实验结果表明微阵列和法对芯片检测结果进行了验证。实验结果表明微阵列和PCR 方法检测的方法检测的miRNA 的表
19、达基本一致的表达基本一致,但也有些差异。用但也有些差异。用RT-PCR 方法检测到方法检测到K562 细胞中细胞中miR-17-5p 的高表达的高表达,而在微阵列中却显示其在而在微阵列中却显示其在K562 细胞中表达细胞中表达水平较低。这可能是由于水平较低。这可能是由于:K562 细胞中的前体细胞中的前体miRNA 和成熟和成熟miRNA 表达量都非常高表达量都非常高,虽然标记反应没有对虽然标记反应没有对pre-miRNA 进行荧光标记进行荧光标记,但在杂但在杂交过程中大量的交过程中大量的pre-miRNA 仍可能和相对较少的成熟仍可能和相对较少的成熟miRNA 竞争竞争,影响影响了荧光标记的
20、成熟了荧光标记的成熟miRNA 与探针的结合与探针的结合,掩盖了掩盖了K562中中miR-17-5p 信信号号;或是实验过程中的系统误差或是实验过程中的系统误差,这种情况在普通的生物芯片技术中也这种情况在普通的生物芯片技术中也存在。因此存在。因此,除了要在芯片实验过程中尽量减少人为干扰除了要在芯片实验过程中尽量减少人为干扰,进一步改进实进一步改进实验技术减少系统误差外验技术减少系统误差外,在对某一在对某一miRNA 进行深入研究之前进行深入研究之前,用其他方法用其他方法确定基因芯片结果是有必要的。本实验方法具有快速、平行、高通量的特确定基因芯片结果是有必要的。本实验方法具有快速、平行、高通量的特点。通过监控细胞点。通过监控细胞miRNA 的表达的表达,可以帮助我们更好地了解这类小核酸可以帮助我们更好地了解这类小核酸分子的功能及作用机制。分子的功能及作用机制。miRNA 表达的比较性研究将可能发现新的诊断表达的比较性研究将可能发现新的诊断性标志分子或治疗性靶分子。性标志分子或治疗性靶分子。
