1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术原理、应用及实践原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCR 主要内容主要内容 Real-time qPCR的定量原理的定量原理2Real-time qPCR的检测方法的检测方法3Real-time qPCR的基本概念的基本概念 1Real-time qPCR的解析方法的解析方法 4PCRPCR：基本原理：基本原理Denaturation:94 96CAnnealing:50 65CExtension:70 75C基本要素：基本要素：Template Primers DN
2、A polymerase dNTP,N=A,G,C or T PCRPCR：基本原理：基本原理理想的理想的PCR反应：反应：N=N0*2n实际的实际的PCR反应：反应：N=N0*(1+E)nN0：初始模板量：初始模板量N：第：第n次循环后的产物量次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 E：扩增效率：扩增效率S形曲线，具有平台效应形曲线，具有平台效应 与普通与普通PCRPCR的对比的对比同一个样本进行同一个样本进行9696次重复次重复传统传统PCR检测检测Real time PCR Real time PCR 检测检测v Real time PCR-Real time PC
3、R-起点检测起点检测：-起点量是样本中起始的起点量是样本中起始的DNADNA量量-“加入了加入了500500个拷贝个拷贝”-具有重现性，误差小具有重现性，误差小v 传统传统PCR-PCR-终点检测终点检测：-终点产物量经过终点产物量经过PCRPCR放大的放大的DNADNA量量-“生成了生成了500500，00000000，00000000个拷贝个拷贝”-不恒定，误差大不恒定，误差大传统传统PCR检测检测Real-time qPCR激发光激发光发射光发射光-在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团。反应体系中加入荧光基团。-荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。荧光基团在激发光的作用下，
4、产生波长更长的发射光。-利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。荧光基团荧光基团 扩增曲线扩增曲线（primary curve）扩增曲线：扩增曲线：随着随着PCRPCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cycle number（循环数）线性图线性图对数图对数图 荧光阈值（
5、荧光阈值（threshold）基线基线(baseline)(baseline)：一般以一般以PCRPCR反应前反应前1515个循环的荧光信号作为本底信号个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值荧光阀值(threshold)(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值扩增曲线上人为设定的一个值-缺省设置：缺省设置：PCRPCR反应前反应前3-153-15个循环荧光本底信号标准偏差的个循环荧光本底信号标准偏差的1010倍倍-手动设置：大于样本的荧光背景值手动设置：大于样本的荧光背景值 Ct 值值(Cycle Threshold)CtCt值值：PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到扩增过程
6、中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的设定的阈值时，荧光值所对应的PCRPCR循环次数。循环次数。起始模板量起始模板量 基线基线 阈值阈值 CtCt值值 Ct 值值(Cycle Threshold)CtCt值的特点值的特点：相同模板进行相同模板进行9696次扩增，平台期次扩增，平台期DNADNA拷贝数波动拷贝数波动很大，但很大，但CtCt值相对固定；值相对固定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性CtCt值可以确定初始模板量？值可以确定初始模板量？R Rn n=R=RB B+X+X0 0 (1+E)(1+E)N N*R RS S第第n n个循环的总信号个循环的总信号 =本底信号
7、本底信号 +起始起始DNADNA数目数目 *PCRPCR扩增效率扩增效率 *单位信号强度单位信号强度当循环次数当循环次数n=Ctn=Ct时时R RCtCt=R=RB B+X+X0 0 (1+E)(1+E)Ct Ct*R RS S两边同时取对数得两边同时取对数得:lg(Rlg(RCtCt-R-RB B)=lgX)=lgX0 0+Ctlg(1+E)+lgR+Ctlg(1+E)+lgRS SCt=-lgXCt=-lgX0 0/lg(1+E)+lg(R/lg(1+E)+lg(RCtCt-R-RB B)-lgR)-lgRS S/lg(1+E)/lg(1+E)Ct=-klgXCt=-klgX0 0+b+b
8、lgXlgX0 0与与CtCt值呈线性关系值呈线性关系根据根据CtCt值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。Rn vs.Cycle number-Rn vs.Cycle number-扩增曲线扩增曲线LogDNA vs.Ct-LogDNA vs.Ct-标准曲线标准曲线.未知未知10410310610510210标准曲线标准曲线(standard curve)标准曲线分析标准曲线分析-对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释y=-ax+b y=-ax+b 测定荧光定量
9、测定荧光定量PCRPCR反应的有效性反应的有效性-线性的标准曲线：相关系数线性的标准曲线：相关系数R R2 2-扩增效率：扩增效率：扩增效率扩增效率(E)=10(E)=10-1/-1/斜率斜率-1-1 标准曲线标准曲线分析分析 荧光定量荧光定量PCRPCR检测方法检测方法染料标记：染料标记：SYBR Green I探针标记：探针标记：水解探针：水解探针：TaqMan非水解探针：非水解探针：Molecular beacon SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green ISYBR Green I 是是一种与双链一种与双链DNADNA小小沟结合的荧光
10、染料。沟结合的荧光染料。l SYBR Green ISYBR Green I只只与双链与双链DNADNA结合才结合才能发出荧光。能发出荧光。l 荧光信号与双链荧光信号与双链DNADNA分子数成正分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。比，随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系中荧光信号强度与反应体系中所有双链所有双链DNADNA分子成正比。分子成正比。5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitation-变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光信号。双链分开，无荧光信号。-延伸结束时，采集荧光信号。延伸结束时，采集荧光信号。SYBR Green I S
11、YBR Green I 工作原理工作原理 SYBR Green I SYBR Green I优点：优点：v 使用方便，成本低使用方便，成本低-仅需设计两个引物仅需设计两个引物v 通用性好通用性好-对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：缺点：v SYBR GreenSYBR Green与所有双链与所有双链DNADNA结合结合-引物二聚体或错误扩增产引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性物造成假阳性-只能检测单一模板，无法只能检测单一模板，无法进行多重检测进行多重检测 将温度对荧光强度的变化求导。将温度对荧光强
12、度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT)融解曲线融解曲线 (dissociation curve)确认确认PCRPCR反应产物的特异性反应产物的特异性 对数图谱对数图谱 原始图谱原始图谱融解曲线分析融解曲线分析-非特异性产物非特异性产物-引物二聚体引物二聚体 Taqman 工作原理工作原理v 探针与靶序列配对探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，（一段序列，两个基团，5 5 报告基团、报告基团、3 3淬灭基团）淬灭基团）v 完整的探针，报告基团完整的探针，报告基团R R发射的荧光被淬灭基团发射的荧光被淬灭基团QQ淬灭，淬灭，没有荧光产生。没有荧光产生。v 聚合酶的聚合酶的5 5外切酶活
13、性外切酶活性v 报告基团报告基团R R与淬灭基团与淬灭基团QQ分离，发射荧光。分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。Taqman 工作原理工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被Taq酶的酶的5-3 外切酶活性剪切成片断外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 SYBR Green I与与Taqman 对比对比Taqmanv特异性高特异性高-与特异靶序列结合v对模板
14、有选择性对模板有选择性-可进行多重PCR反应 SYBR Green Iv 使用方便，成本低使用方便，成本低-仅需设计两个引物v通用性好通用性好-对DNA模板没有选择性 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法v绝对定量绝对定量 样本中核酸的量（拷贝数、微克）样本中核酸的量（拷贝数、微克）-检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝v相对定量相对定量 不同样本中目的基因表达量的差异不同样本中目的基因表达量的差异-肿瘤组织和正常组织相比 某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍绝对定量的步骤绝对定量的步骤拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光
15、定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品Ct代入标准曲线代入标准曲线确定拷贝数确定拷贝数质粒提取质粒提取OD值测定值测定计算待测样本浓度计算待测样本浓度/样本分子量样本分子量/待测样本拷贝数待测样本拷贝数标准品进行标准品进行5-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数为标准品稀释倍数为10绝对定量绝对定量Sample-样本起始浓度与样本起始浓度与CtCt呈线性关系，根据已知拷贝的标呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。准品作出标准曲线。-根据未知样品的根据未知样品的CtCt值，推算出未知样本量。值，推算出未知样本量。以标准品为标杆以标准品为标杆相对定量相对定量 参照样
16、本参照样本 Calibrator用于比较结果的基准。用于比较结果的基准。相对定量相对定量 特点特点选择内参基因选择内参基因内参基因内参基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、18S rRNA18S rRNA等等看家基因看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量在细胞中的表达量或在基因组中的拷或在基因组中的拷贝数恒定，受环境贝数恒定，受环境因素影响较小因素影响较小-文献检索文献检索-实验筛选实验筛选内参基因内参基因-同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。-RNA-RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。抽提
17、、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。2-Ct法法成立条件：成立条件：假设扩增效率为假设扩增效率为100%满足条件：满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件：假设条件：内参基因和目标基因扩增效率差异大于内参基因和目标基因扩增效率差异大于5%1）优化实验条件，使扩增效率接近）优化实验条件，使扩增效率接近 2）使用其他方法）使用其他方法 相对定量方法相对定量方法 2-Ct法法 相对定量举例相对定量举例相
18、对定量分析相对定量分析 待测样品目的基因 浓度 待测样品内参基因 浓度 F=对照样品目的基因 浓度 对照样品内参基因 浓度假设条件：假设条件：内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：优点：实验优化简单实验优化简单 缺点：缺点：每一轮实验都必需做标准曲线每一轮实验都必需做标准曲线 双标准曲线法双标准曲线法80%相对定量举例相对定量举例 双标准曲线法双标准曲线法 实实 验验 流流 程程 SYBR Green法实验流程法实验流程 样本处理样本处理RNARNA提取提取qPCR数据分析数据分析逆转录逆转录 样本处理与样本处理与RNA提取提取v 外界刺激外界刺激 10min 可
19、检测的表达改变可检测的表达改变v 样品离开定义环境样品离开定义环境 2min 裂解、固定细胞裂解、固定细胞TRIzon（酚、异硫氰酸胍）裂解液（氰酸胍，异硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液 v 小心小心DNA污染！污染！使用DNase 阴性对照 逆转录逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？RT-PCR一步法还是两步法？一步法还是两步法？两步法两步法:反转录和反转录和PCRPCR扩增分两步进行。扩增分两步进行。步骤多但灵活多样。步骤多但灵活多样。cDNAcDNA可长期保留检测可长期保
20、留检测 多个基因。便于反应优化。在多个基因。便于反应优化。在工作的初期。工作的初期。一步法：一步法：反转录和反转录和PCRPCR扩增在同一管内完成。扩增在同一管内完成。简便、快捷但只做一个基因，一旦失败简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。难以查找原因。在工作的成熟阶段。荧光定量荧光定量PCR体系体系 Template Primers DNA聚合酶 Buffer and dNTPs Dye总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同：相同：v 避免引物二聚体，避免二级结构避免引物二聚体，避免二级结构v 扩增片段长度（扩增片段长度（80-300bp)80-300bp)v
21、 推荐做跨推荐做跨intronintron设计设计引物设计原则引物设计原则Master mix使用使用Master mix有效降低系统误差有效降低系统误差-热启动酶热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒-Buffer 反应增强剂反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂稳定剂-Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mixMaster mix的优化的优化新型荧光染料新型荧光染料(Super Green(Super Green)激发、发射波长与激发、发射波长与SYB
22、R GreenSYBR Green近似近似对对PCRPCR反应抑制更轻微反应抑制更轻微 可使用较高浓度可使用较高浓度(1uM,SYBR green(1uM,SYBR green 0.3uM)0.3uM)更亮，灵敏度更高更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间较短的链延长时间对小片段对小片段DNADNA和和ssDNAssDNA结合更弱结合更弱 减少背景，有效信号更强减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于更窄，适合于HRMHRM分析分析化学性质更稳定化学性质更稳定致突变性与毒性更弱致突变性与毒性更弱SYBR GreenSuper GreenMas
23、ter MixROX Passive Reference 不参与、不干扰不参与、不干扰PCRPCR反应反应 恒定发射荧光信号恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。的系统误差。有不同系统，需参照仪器要求选择。有不同系统，需参照仪器要求选择。误差控制误差控制v 使用使用Master mixv 配置预混体系配置预混体系v 设置生物学重复（不同个体）设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）技术性重复（复孔）v 阳性和阴性对照阳性和阴性对照 实验环境控制实验环境控制v 试剂准备区试剂准备区v 核酸制备区核酸制备区v 反应液制
24、备区反应液制备区v 荧光定量荧光定量PCR反应区反应区荧光定量荧光定量PCRPCR体系体系 数据分析数据分析 融解曲线：融解曲线：单一特异性产物单一特异性产物 扩增曲线：扩增曲线：-Ct-Ct值大小值大小-各复孔之间重复性各复孔之间重复性-不同浓度梯度稀释的间隔性不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线：标准曲线：-R-R2 20.9800.980或或 r r 0.9900.990-反应效率尽可能高：反应效率尽可能高：90%-110%90%-110%-目的基因的扩增效率接近内参基因目的基因的扩增效率接近内参基因操作注意事项操作注意事项 为避免加样误差，保证重复性，为避免加样误差，保证重复性，配制预混
25、体系配制预混体系 配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打 低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心 不要直接在八连管上进行标记不要直接在八连管上进行标记 避光保存，试剂分装避免反复冻融避光保存，试剂分装避免反复冻融 酒精擦拭移液器的吸头酒精擦拭移液器的吸头 设置反应重复（至少二个）设置反应重复（至少二个）设置对照设置对照案例分析案例分析 总体原则总体原则v偶然因素-操作原因v实验重复 生物学重复、技术性重复v机器因素 仪器加样孔v结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析v单孔和多孔分析v内参基因和目的基因对比分析案例
26、分析案例分析 扩增曲线扩增曲线v曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。v扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。v模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。vCt 15-35v重复性 扩增曲线-低浓度样本没有稀释好-重复性差，加样存在误差案例分析案例分析 扩增曲线扩增曲线案例分析案例分析 扩增曲线扩增曲线 无信号或Ct值偏大v 内参基因和目的基因均无信号内参基因和目的基因均无信号-RNA降解v 内参基因和目的基因均偏大内参基因和目的基因均偏大-模板量低-对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起v 内参基因正常，而目的基因偏内参基因正常，而目的基因偏大或无信号大或无信号 -引物设计-目的基因表达量低
27、案例分析案例分析vQ内参基因与目的基因的Ct值之差在多大范围内可以接受？vA：-在使用2-Ct法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因和目的基因的扩增效率相接近并且足够高，在90%-110%之间，因此内参基因与目的基因的差值是可以接受的。-内参基因和目的基因的Ct值在15-35以内，并且重复管之间的重复性很好，这样的数据都是可以接受的。案例分析案例分析 扩增曲线扩增曲线扩增曲线不平滑-样本浓度太低-原始信号弱关闭ROX校正信号案例分析案例分析 扩增曲线扩增曲线扩增曲线很早扬起-样本浓度太高（稀释样品浓度）案例分析案例分析 熔解曲线熔解曲线熔解曲线出现双峰v引物峰引物峰：-阴性对照（体系污染，配
28、合扩增曲线）-降低引物浓度-重新设计引物v非特异性扩增非特异性扩增-基因组污染-非特异片段（重新设计引物）案例分析案例分析 熔解曲线熔解曲线非正常熔解曲线-试剂污染-仪器需要校正v各点之间线性关系v各孔的重复性vR2相关系数vSlope E 反应效率 案例分析案例分析 标准曲线标准曲线 案例分析案例分析 标准曲线标准曲线标准曲线的线性关系不佳-加样存在误差-样品稀释不准确使得标准曲线不呈梯度。扩增效率低（引物的扩增效率、引物与模板的最适比例）-调节引物终浓度 案例分析案例分析 标准曲线标准曲线Trouble shootingHousekeeping geneHousekeeping gene
29、无信号无信号RNARNA降解降解用新鲜组织提取用新鲜组织提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目标基因无信号而目标基因无信号1.1.目的基因表达低。目的基因表达低。逆转录效率不高逆转录效率不高2.PCR2.PCR引物不良引物不良1.1.富集富集mRNA mRNA 2.2.在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3.3.尝试不同尝试不同PCRPCR引物。减小产物大小，改换目标引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。区段，考虑不同剪接体。4.4.尝试不同热循程序，降低复性温度。尝试不同热循程
30、序，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反应效率正常反应效率正常,但但目标因放大效率不高目标因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体考虑不同剪接体目标基因表达丰度在目标基因表达丰度在样本之间异常一致样本之间异常一致RNARNA被基因组被基因组DNADNA污染污染1.1.使用跨使用跨intron intron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处理处理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性对照表现阴性阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰溶解曲线
31、出现杂峰1.1.出现非特异出现非特异PCRPCR产物产物2.2.出现引物二聚体出现引物二聚体1.1.尝试不同尝试不同PCRPCR引物引物2.2.尝试不同热循程序，升高复性温度尝试不同热循程序，升高复性温度3.3.修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与温度与PCRPCR特异产物解链温度之间。特异产物解链温度之间。阴性对照在阴性对照在3030个循环个循环以内出现信号以内出现信号试剂被污染试剂被污染1.1.注意区分信号是来自引物二聚体还是注意区分信号是来自引物二聚体还是PCRPCR产物产物2.2.查找，替换污染试剂查找，替换污染试剂3.3.使用使用UNGUNG系统。系统。
