1、霍乱的实验室检测长春市疾病预防控制中心长春市疾病预防控制中心霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定一一霍乱实验室诊断的相关实验技术霍乱实验室诊断的相关实验技术二二霍乱的实验室检测霍乱的实验室检测霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定1 1、样本的采集、样本的采集2 2、样本的送检、样本的送检3 3、分离培养、分离培养4 4、菌株鉴定、菌株鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定1 1、样本的采集、样本的采集患者的粪便、呕吐物、肛拭子为必须标本。患者的粪便、呕吐物、肛拭子为必须标本。水样便或呕吐物采样量一般为水样便或呕吐物采样量一般为1mL-3mL，成型，成型便采取指甲大小的粪量；肛拭子
2、可用直肠棉拭便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内或采便管由肛门插入直肠内3cm-5cm处旋转处旋转后取出。后取出。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定2 2、样本的送检、样本的送检采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入的，应放入PH值值8.8-9.0碱性蛋白胨水或文腊二碱性蛋白胨水或文腊二氏保存液或插入氏保存液或插入Carry-Blair半固体保存培养基半固体保存培养基中送检。中送检。标本与保存液的比例约为标本与保存液的比例约为1:5。病人标本含有大量病菌，标本装入试管或小瓶时，病人标本含有大量病菌，标本装
3、入试管或小瓶时，注意勿污染容器口外壁，必须妥善包装，运送中注意勿污染容器口外壁，必须妥善包装，运送中注意安全。注意安全。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定3 3、分离培养、分离培养増菌后的分离培养：増菌后的分离培养：所有标本均应接种碱性蛋白胨水培养基，所有标本均应接种碱性蛋白胨水培养基，37増菌増菌6h-8h。从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择培养基各一个，于强、弱选择培养基各一个，37培养培养18h-24h。必要时进行二次増菌。必要时进行二次増菌。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定3 3、分离培养、分离培养直接分离培养：直接分
4、离培养：对急性期患者水样便标本，在进行増菌培养对急性期患者水样便标本，在进行増菌培养的同时可取一接种环或用肛拭子直接接种在选择的同时可取一接种环或用肛拭子直接接种在选择性培养基上，性培养基上，37培养培养18h-24h。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定3 3、分离培养、分离培养强选择性培养基：庆大霉素琼脂，强选择性培养基：庆大霉素琼脂，TCBS琼琼脂和四号琼脂等脂和四号琼脂等弱选择性培养基：碱性营养琼脂弱选择性培养基：碱性营养琼脂霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定3 3、分离培养、分离培养不同选择培养基上生长的霍乱弧菌典型菌落特征：不同选择培养基上生长的霍乱弧菌典型菌落特征：碱性
5、营养琼脂：较大，无色，圆形，透明或半透明、表面光碱性营养琼脂：较大，无色，圆形，透明或半透明、表面光滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐，水滴状，菌落直径一滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐，水滴状，菌落直径一般约为般约为2mm庆大霉素琼脂和四号琼脂：透明性略差，多呈半透明状，菌庆大霉素琼脂和四号琼脂：透明性略差，多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深TCBS琼脂：黄色发亮，表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整琼脂：黄色发亮，表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐齐霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定3 3、分离培养、分离培养霍乱弧菌
6、在霍乱弧菌在TCBS琼脂平板上的菌落特征（琼脂平板上的菌落特征（18h-24h）霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.1 染色染色O1群霍乱弧菌为革兰阴性、弯曲呈弧状，无芽孢，群霍乱弧菌为革兰阴性、弯曲呈弧状，无芽孢，无荚膜，菌体两端钝圆或稍平，单端鞭毛；无荚膜，菌体两端钝圆或稍平，单端鞭毛；O139群霍乱弧菌的形态及运动与群霍乱弧菌的形态及运动与O1群霍乱弧菌群霍乱弧菌近似，但是近似，但是O139群霍乱弧菌菌体周围有一层比较群霍乱弧菌菌体周围有一层比较薄的荚膜。薄的荚膜。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定霍乱弧菌纯培养的镜下形态
7、（革兰染色）霍乱弧菌纯培养的镜下形态（革兰染色）霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.2 玻片凝集试验玻片凝集试验 取纯培养物与取纯培养物与O1群霍乱弧菌诊断用单克隆抗群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或体或O1群多价诊断血清及群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验。用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验。剩余菌落亦可用来做单价血清的玻片凝集，以剩余菌落亦可用来做单价血清的玻片凝集，以确定血清型。确定血清型。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.2 玻片凝集试验玻片凝集试验 生长在生长在TC
8、BS上的疑似菌落常因培养基中蔗糖上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验。的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验。要注意同一标本存在要注意同一标本存在O1群和群和O139群等多个群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选5个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.3 氧化酶试验氧化酶试验试剂：试剂：1%盐酸对氨基二甲苯胺或盐酸二甲基对苯盐酸对氨基二甲苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液二胺水溶液试验方法：取生长在非选择性培养基
9、上的新鲜培养试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加上述试剂，如培物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加上述试剂，如培养物在养物在1-2min内出现粉红内出现粉红-紫红紫红-紫蓝色，有的最紫蓝色，有的最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。色判为阴性。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.4 菌株复核菌株复核经初筛阳性或可疑阳性的菌株，应尽快送当地疾病经初筛阳性或可疑阳性的菌株，应尽快送当地疾病预防控制中心进行复核鉴定。预防控制中心进行复核鉴定。复核结果符合复核结果符合O1群
10、或群或O139群霍乱弧菌的菌株，群霍乱弧菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上CDC进进行确认分析。行确认分析。霍乱弧菌的分离与鉴定霍乱弧菌的分离与鉴定4 4、菌株鉴定、菌株鉴定4.4 菌株复核菌株复核菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰染色、以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、动力试验。黏丝试验、氧化酶试验、动力试验。生化反应：生化反应：葡
11、萄糖（葡萄糖（+）、麦芽糖（）、麦芽糖（+）、）、阿拉伯胶糖（阿拉伯胶糖（-）、氧化酶（）、氧化酶（+）、）、DNA酶（酶（+）、霍乱红（）、霍乱红（+）霍乱实验室诊断的相关实验技术霍乱实验室诊断的相关实验技术1 1、霍乱弧菌基因、霍乱弧菌基因PCRPCR检测检测霍乱毒素是霍乱弧菌主要的致病因子，在霍乱诊断霍乱毒素是霍乱弧菌主要的致病因子，在霍乱诊断上霍乱毒素基因（上霍乱毒素基因（ctxAB）的）的PCR检测具有重要检测具有重要的诊断价值。的诊断价值。特异性和灵敏度均较高，特异性和灵敏度均较高，需符合需符合PCR试验条件的实验室，试验条件的实验室，需要严格的核酸提取操作，需要严格的核酸提取操作，直接检测是否为产毒株。直接检测是否为产毒株。霍乱实验室诊断的相关实验技术霍乱实验室诊断的相关实验技术2 2、霍乱弧菌快速辅助检测、霍乱弧菌快速辅助检测霍乱弧菌胶体金快速检测法霍乱弧菌胶体金快速检测法主要针对检测主要针对检测O1群和群和O139群霍乱弧菌抗原成分，群霍乱弧菌抗原成分，操作简单。操作简单。检出限检出限105个菌个菌/毫升，存在漏检可能，需增菌后毫升，存在漏检可能，需增菌后检测。检测。敬请各位指正！敬请各位指正！谢谢！谢谢！
