1、革兰染色与分离培养,北医三院 检验科 侯秀竹,革兰染色 细菌分离培养,目的和内容,样本采集,早期采集 无菌采集 根据目的菌的特性用不同的方法采集 采集适量标本 安全采集,样本处理,送检时间 包装严密 选择培养基进行培养,立即保温送检（脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌）,2小时内送检/保存24小时内送检,4C保存 痰、尿、便、支气管洗液等,25C保存 脑脊液、滑膜液,培养基的定义,培养基（culture medium) 由人工方法配制而成，专供微生物成长繁殖使用的混合营养物制品。,培养基的种类,1.凝固物质 2.营养物质 蛋白胨（氮源） 肉浸液（氮源，碳源） 牛肉膏 碳源、醇类 血液 无机
2、盐类 生长因子 鸡蛋和动物血清：结核，白喉 3.抑制剂和指示剂,基础培养基 （肉汤）,营养培养基 （血平板，巧克力平板）,鉴别培养基,选择培养基,培养基的配制,培养基的选择,痰标本 血平板 中国蓝 巧克力 尿标本、咽拭子、分泌物 血平板 中国蓝 便标本 血平板 中国蓝 SS琼脂,分离培养,平板划线培养法 通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面上充分散开，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获得纯种，则挑取一个单个菌落做纯培养。,分离培养,平板划线培养法,分离培养,涂布接种法,分离培养,细菌培养方法 需氧培养法 最常用，适用于一般需氧和兼性厌氧菌的培养，35温箱中孵育18-24h CO2培养
3、法 5-10% CO2环境 厌氧培养法,菌落观察,形状（圆形、不规则形） 大小（大、中、小、针尖样大小） 颜色 是否透明 表面情况（隆起、凹陷、褶皱等） 是否湿润 是否有溶血 气味,菌落观察-金黄色葡萄球菌,形状：圆形 大小：中、小 颜色：白色、金黄色、柠檬色 不透明 表面情况：隆起 湿润 溶血,菌落观察-铜绿假单胞菌,血平板上毛玻璃样，金属光泽，生姜味，有透明溶血环,菌落观察-铜绿假单胞菌,粘液型,干燥型,菌落观察-铜绿假单胞菌,可产生多种色素 荧光素与绿脓素,铜绿假单胞菌产荧光素,菌落观察-铜绿假单胞菌,铜绿假单胞菌产绿脓素,菌落观察-白假丝酵母菌,沙氏（Sabouraud）培养基 奶油色
4、类酵母型菌落,真菌菌落分类,酵母型菌落,单细胞真菌 与一般细菌菌落相似 较大，表面光滑，湿润，柔软，边缘整齐,霉菌型菌落,多细胞真菌 菌落呈棉絮状、绒毛状、粉末状，并产生不同色素,菌落观察-白假丝酵母菌,沙氏（Sabouraud）培养基 奶油色类酵母型菌落,细菌形态观察,不染色,检查生活状态下细菌的动力和运动状况。,染色,革兰染色 抗酸染色 荧光染色 特殊染色 负染,细菌形态观察-革兰染色,革兰氏染色(Gram stain)是丹麦医生革兰 (Hans Christian Gram)于1884年发明的。 细菌学中最经典、最常用的染色方法。 将细菌分为G+菌和G-菌。,紫色为革兰阳性（ G+菌）
5、红色为革兰阴性（G-菌）,细菌形态观察-革兰染色,细菌形态观察-革兰染色,细菌形态观察-革兰染色,细胞壁,细菌形态观察-革兰染色,细胞壁,细菌形态观察-革兰染色,细菌形态观察-革兰染色,革兰染色原理 革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。,细菌形态观察-革兰染色,鉴定试验,生化反应试验 血清学试验 分子生物学 药物敏感性试验,实验内容1革兰染色,制片,涂片：洁净
6、载玻片标记生理盐水少许待测菌/标本、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌涂成均匀薄膜 干燥 ：室温下自然干燥。必要时将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯 固定：干燥后将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。 固定目的：杀死细菌；使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；菌体蛋白变性易着色。,实验内容1革兰染色,革兰染色 在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴，室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。 再滴加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。 滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟
7、，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。,实验内容1革兰染色,涂片,干燥,固定,染色,镜检,实验内容1革兰染色,镜下观察细菌形态（绘图） 判断细菌为那种细菌（G+ or G-） 白假丝酵母菌为真菌观察其染色情况，并分析原因,实验内容1革兰染色,实验内容1革兰染色,镜下观察细菌形态（绘图） 判断细菌为那种细菌（G+ or G-） 白假丝酵母菌为真菌观察其染色情况，并分析原因,实验内容2尿液培养,实验内容2尿液培养,培养要点 点灯 右手拿接种环，左手握琼脂平板 在酒精灯左前上方，平板面向火焰 接种环与琼脂呈30-40角度 （三区划线）第一区占整板1/5-1/6，第二区占1/4（每区结束时烧灼灭菌） 涂布接种需特定接种环（不需烧灼） 划线完毕，将平板扣入皿盖，并标记,Thanks,
