1、实验一土壤中微生物的分离及纯化（设计性实验）2020/4/91一、目的要求?掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。?学习平板菌落计数的基本原理和方法。2020/4/92二、基本原理?在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。2020/4/93?为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境
2、，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。?土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。2020/4/942020/4/95?平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样
3、品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的23或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-formingunits，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。2020/4/962020/4/97三、器材?高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml 无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。?大肠杆菌菌悬液、牛肉膏蛋白胨培养基。lm1 无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml 无菌水的试
4、管，试管架，恒温培养箱等。2020/4/98四、操作步骤?1稀释涂布平板法（1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏 1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至5560时，向高氏1号琼脂培养基中加入 10酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素 30g/mL。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻
5、轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。2020/4/992020/4/910也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图-1所示。最好是将平板放室温23天，或 37培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。2020/4/911（2）制备）制备 土壤稀释液称取土样 10g，放入盛，放入盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 土土壤悬液注入盛有9ml 无菌水的试管中，吹吸无菌水的试管中，吹
6、吸三次，使充分混匀。然后再用一支 1ml 无菌吸管从此试管中吸取 1ml 注入另一盛有注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 各种稀释度的土壤溶液。2020/4/912（3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5 和10-6 三种稀释度，然后用三支 1ml 无菌吸管分别由10-4、10-5 和10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，如图-2所示。2020/4/913（4）培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于
7、28温室中培养35日，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23日。（5）挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28和37温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。2020/4/914?2平板划线分离法（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。（2）划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1 的土壤悬液一环在平板上划线（图-5）。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。202
8、0/4/9152020/4/916常用的划线方法有下列二种：?1）用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。?2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。2020/4/917（3）挑菌 同稀释涂布平板法，一直到菌分纯为止?3、平板菌落计数法l）编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-
9、6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL 无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2020/4/9182）稀释用用lmL 无菌吸管吸取lmL 已充分混匀的大肠杆菌菌已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml 至至10-1 的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将将10-1 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml 吸管插入10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取 10-1 菌液lmL，精确地放，精确地放0.5mL 至10-2 试管中，此即为100 倍稀释。其余依次类推，整个过程如图 VIII-3 所示。所示。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。2020/4/919
