1、生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四章第四章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 第二节第二节 主要分离类型主要分离类型第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相第四节第四节 影响分离的因素与分离类型的选择影响分离的因素与分离类型的选择生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪美国安捷伦公司美国安捷伦公司 Agilent 1200生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪美国戴安公司美国戴安公司 UltiMa
2、te3000生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪一、一、高效液相色谱仪结构流程高效液相色谱仪结构流程 二、二、高压输液系统高压输液系统三、三、梯度淋洗装置梯度淋洗装置六、六、液相色谱检测器液相色谱检测器五、五、分离系统分离系统四、四、进样系统进样系统生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪储液瓶储液瓶高压泵高压泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器废液废液一、一、高效液相色谱仪结构流程高效液相色谱仪结构流程 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器
3、生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪二、二、高压输液系统（高压泵）高压输液系统（高压泵）要求：要求：输出压力高；输出压力高；平稳、脉冲小；平稳、脉冲小；流量稳定可调；流量稳定可调；耐腐蚀。耐腐蚀。机械往复柱塞泵结构图机械往复柱塞泵结构图生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪三、三、梯度淋洗装置梯度淋洗装置 在液相色谱中在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。极性来改善分离和调节出峰时间。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器
4、分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。比例送入混合器，混合后进入色谱柱。一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。高压梯度高压梯度(外梯度外梯度)低压梯度低压梯度(内梯度内梯度)生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪通过改变流动相的组成来调整组分通过改变流动相的组成来调整组分的的k值，改
5、变分离因子值，改变分离因子值，以达到值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离,加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形,减少拖尾减少拖尾;可能引起可能引起基线漂移。基线漂移。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪四、四、进样系统进样系统六通阀进样六通阀进样 装置装置生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪内径：内径：16 mm，柱长：柱长：550 cm；柱填料粒径：柱填料粒径：5 10m 为保
6、护色谱柱，为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。五、五、分离系统（色谱柱）分离系统（色谱柱）生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪六、六、液相色谱检测器液相色谱检测器类类型型紫外检测器紫外检测器示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器电导检测器电导检测器生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（一）、紫外检测器（一）、紫外检测器应用最广泛的检测器应用最广泛的检测器基本原理：基本原理：试样组分对特
7、定波长的紫外光具有选择试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯符合郎伯-比耳定律。比耳定律。优点：优点：灵敏度高，线形范围宽；灵敏度高，线形范围宽；死体积小；死体积小；波长可选；波长可选；对流速和温度变化不对流速和温度变化不 敏感；敏感；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。缺点：缺点：无紫外无紫外-可见吸收组分不响应；可见吸收组分不响应；流动相选择受一定限制。流动相选择受一定限制。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶
8、剂的紫外截止波长溶剂溶剂二硫二硫化碳化碳氯仿氯仿四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截止紫外截止波长波长/nm380245212210190205187生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪(a)可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器二极管阵列检测器生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器二极管阵列检测器峰纯度峰纯度检验检验生物与化学工程学院生物与化学
9、工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（二）、示差折光检测器（二）、示差折光检测器通用型检测器通用型检测器基本原理：基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。度成正比。每种物质具有不同的折光指数每种物质具有不同的折光指数。生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。一般要用示差折光检测器。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相
10、色谱仪 缺点：缺点：灵敏度低；灵敏度低；对温度敏感；对温度敏感；不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（三）、荧光检测器（三）、荧光检测器专用型检测器专用型检测器 基本原理：基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。相中的组分的浓度成之比。对多环芳对多环芳烃，维生素烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器
11、分析第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 特点：特点：高灵敏度；高灵敏度；高选择性；高选择性；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱二、液二、液-液分配与化学键合相色谱液分配与化学键合相色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱四、离子对色谱四、离子对色谱五、空间排阻色谱五、空间排阻色谱六、亲和色谱六、亲和色谱生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
12、各种不同极性的一元或多元溶剂。固定相固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。颗粒度较小，颗粒度较小，5-10m分离机理：分离机理：流动相中的溶质分子流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子与溶剂分子(S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。在固体吸附剂上竞争吸附的结果。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型MSSMXnSXnS 下标下标M、s分别代表流动相和固定相，分别代表流动相和固定相，n代表被吸附的代表被吸附的溶剂分子数；溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。代表吸附平衡常数。吸附平衡常数吸附平衡常数K不等于分配系数。不等于分配
13、系数。K值越大，保留时间越长，分配系数大。值越大，保留时间越长，分配系数大。适用对象：适用对象：相对分子质量中等的油溶性试样，对相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型二、液二、液-液分配与化学键合相色谱液分配与化学键合相色谱（一）、液（一）、液-液分配色谱液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）。固定相与流动相均为液体（互不相溶）。基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。：组分在固定相和流动相上的分配。与气相色与气相色谱
14、中气谱中气-液液色谱比较？色谱比较？改变流动相的组成来改变流动相的组成来 改善分离效果。改善分离效果。K不仅与固定相的种不仅与固定相的种类有关，也与流动相类有关，也与流动相的种类有关。的种类有关。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱（正相柱）（正相柱）组分极性越大，保留组分极性越大，保留时间越长；使用极性时间越长；使用极性化合物的分离。化合物的分离。反相分配色谱反相分配色谱（反相柱）（反相柱）固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性组分极性越小，保留组分极性越小，保留时间越长；
15、适用非极时间越长；适用非极性化合物的分离。性化合物的分离。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型（二）、化学键合固定相色谱（二）、化学键合固定相色谱 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。适用于种类繁多样品的分离。特点特点 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。（担体）表面的游离羟基上。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析
16、第二节第二节 主要分离类型主要分离类型1.键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围：2-8生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型2.键合固定相类型键合固定相类型类类型型反相柱反相柱正相柱正相柱氨丙基氨丙基氰乙基、醚和醇等氰乙基、醚和醇等极性基团极性基团不同碳原子数的不同碳原子数的烷烃（烷烃（C8和和C18）、）、苯基等疏水基团苯基等疏水基团生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 主要分离类型主要分离类型保留时间：
17、保留时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相:非极性非极性;流动相流动相:极性极性组分极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酸乙酯乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己
18、烷煤油煤油(最小最小)常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。选择流动相时应注意的问题选择流动相时应注意的问题2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。氧化铝固定相等。生物与化学工程学院
19、生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。产生沉淀并在柱中沉积。4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素一、影响分离的因素二、分离类型的选择二、分离类型的选择生物与化学工程学院生物与化学工程学
20、院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素一、影响分离的因素速率方程速率方程2BD溶质在液相流动相溶质在液相流动相中的扩散系数，约中的扩散系数，约为气相中扩散系数为气相中扩散系数的万分之一的万分之一生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择修正的速率方程：修正的速率方程：A.降低颗粒度大小，填充均匀；降低颗粒度大小，填充均匀；B.减小液膜厚度；减小液膜厚度；C.选择粘度小的溶剂；选择粘度小的溶剂；D.选择较低的流动相流速。选择较低的流动相流速。提高柱效
21、提高柱效途径途径生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择二、分离类型的选择二、分离类型的选择根据分析目的、试样性质、化合物的结构根据分析目的、试样性质、化合物的结构生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析气相色谱与高效液相色谱的比较气相色谱与高效液相色谱的比较气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱1.只能分析挥发性物质，只能分析只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物的化合物2.不能用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析3.用毛细管色谱可得到很高的柱效用毛细管色谱可得到很高的柱效4.有
22、很灵敏的检测器如有很灵敏的检测器如ECD和较灵和较灵敏的通用检测器（敏的通用检测器（FID和和TCD）5.流动相为气体，无毒，易于处理流动相为气体，无毒，易于处理 6.运行和操作容易运行和操作容易 7.仪器制造难度较小仪器制造难度较小1.几乎可以分析各种物质几乎可以分析各种物质 2.用于热不稳定物质的分析用于热不稳定物质的分析 3.色谱柱较短，柱效较低色谱柱较短，柱效较低4.没有较高灵敏通用检测器没有较高灵敏通用检测器 5.流动相有毒，费用较高流动相有毒，费用较高 6.运行和操作比运行和操作比GC难一些难一些 7.仪器制造难度大仪器制造难度大生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析
