1、仪器分析仪器分析供药学类、中药学类、制药工程及相关专业使用供药学类、中药学类、制药工程及相关专业使用全国普通高等中医药院校药学类专业全国普通高等中医药院校药学类专业“十三五十三五”规划教材（第二轮规划教材）规划教材（第二轮规划教材）第四章第四章分子荧光分光光度法分子荧光分光光度法目录目录第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素第三节第三节 荧光光谱仪荧光光谱仪第四节第四节 定性和定量分析方法定性和定量分析方法第五节第五节 荧光法的应用和新技术简介荧光法的应用和新技术简介 4 4 第二节第二节 荧光强度的影响因素荧光强度的影响因素 5 5 I0aaffIF
2、NNtpfaNNNN10f荧光效率荧光效率是发射荧光分子数与是发射荧光分子数与激发分子总数之比，常用激发分子总数之比，常用f表示。表示。它表示物质它表示物质发射荧光的能力发射荧光的能力 6 6 荧光寿命荧光寿命是指当除去激发光源后，分子的荧是指当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，常所需的时间，常用用表示。表示。利用分利用分子荧子荧光寿命的差别，可以进行荧光光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。物质混合物的分析。7 7 I0 8 8 共轭双键结构的分子中共轭双键结构的分子中 跃迁，在跃迁，在UV光区具光区具有较强吸收。同时有较强吸
3、收。同时 的寿的寿命较短，分子命较短，分子碰撞频率碰撞频率减减少，不利于外转换，有利少，不利于外转换，有利荧光发射。荧光发射。9 9 体系的共轭度增加，荧光体系的共轭度增加，荧光-波长红移，效率增大波长红移，效率增大36.029.011.0404nm321nm278nm356nm286nm205nmFemex 10 10 2 刚性共平面结构刚性共平面结构 刚性结构可以减少分子的振动，使分子间相互作刚性结构可以减少分子的振动，使分子间相互作用减少，外转换可能性减少，所以荧光增强；用减少，外转换可能性减少，所以荧光增强；而分而分子的共平面会增强分子共轭度。子的共平面会增强分子共轭度。11 11 1
4、2 12 芳香环上的有取代基：芳香环上的有取代基：l给电子基团给电子基团(-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等等)会与会与芳香环形成芳香环形成p-共轭，增强了共轭，增强了 电子共轭程度，电子共轭程度，使荧光增强。使荧光增强。l 吸电子基团吸电子基团(-COOH、-NO、-CO、卤素等)，会削，会削弱电子共轭性，荧光会减弱弱电子共轭性，荧光会减弱l其它基团其它基团(-SO3H、-NH3+、-R)不影响荧光。不影响荧光。3 3 苯环上取代基的影响苯环上取代基的影响 13 13 温度温度、溶剂溶剂、酸度、酸度、猝灭剂猝灭剂u温度温度的影响的影响温度温度分子间分子间碰撞频率碰撞频率猝灭猝灭去活
5、几率去活几率&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 14 14 u溶剂溶剂的影响的影响极性、极性、粘度粘度 极性极性增大，将使增大，将使 跃迁的能跃迁的能量减小，而导致荧光峰红移，荧光增量减小，而导致荧光峰红移，荧光增强。强。粘度粘度增大增大，分子碰撞频率减小，分子碰撞频率减小，荧光增强。荧光增强。&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 15 15 u酸酸度度的影响的影响&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 16 16 在溶液中在溶液中能引起荧光强度降低能引起荧光强度降低的的物质物质荧光荧光熄熄灭剂灭剂。如。如卤离子、重金属离子、氧卤离子、重金属离子、氧分子、重氮化合
6、物、硝基化合物、羰基化分子、重氮化合物、硝基化合物、羰基化合物等物质合物等物质。u熄熄灭灭剂的影响剂的影响 荧光熄灭荧光熄灭荧光物质分子与溶剂或其它分子作荧光物质分子与溶剂或其它分子作用用引起荧光强度降低引起荧光强度降低的现象的现象。&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 17 17 荧光荧光熄熄灭的主要类型：灭的主要类型：碰撞熄灭碰撞熄灭 静态熄灭静态熄灭 转入转入T1的熄灭的熄灭 S1T1。自熄灭自熄灭 荧光荧光熄灭现象对荧光物质测定不利，但熄灭程熄灭现象对荧光物质测定不利，但熄灭程度与熄灭剂的含量呈线性，可度与熄灭剂的含量呈线性，可利用它利用它分析熄灭剂含分析熄灭剂含量量荧光熄灭
7、法荧光熄灭法。比直接荧光法更灵敏，选择高。比直接荧光法更灵敏，选择高。&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 18 18 I0FIaIsoror单色器单色器u 散射光的影响散射光的影响&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 19 19 拉曼光拉曼光来自溶剂，波长与溶剂和激发光有关来自溶剂，波长与溶剂和激发光有关。激发光波长(nm)248313365405溶剂散射光波长水271350416469醇267344409459环已烷267344408458四氯化碳320375418 荧光荧光波长与物质分子结构有关，波长与物质分子结构有关，选择合适的溶选择合适的溶剂和激发波长。使剂和激发波长。使拉荧&影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素 20 20 IoIaafIFafIF)1()101()1(303.2EcloEclootoaeIITIIII)1(303.2EclofafeIIF&荧光强度与溶液浓度之间的关系荧光强度与溶液浓度之间的关系 21 21 KcF 在低浓度时在低浓度时xexexxx1100303.205.0EclEclEclIeIFofEclof303.2)1(303.2&荧光强度与溶液浓度之间的关系荧光强度与溶液浓度之间的关系
