1、泡菜(乳酸菌)果酒(酵母菌)果醋()应用无菌技术消毒灭菌酒精消毒法 紫外线消毒法灼烧灭菌法干热灭菌法 培养培养基接种计数_平板划线法_显微镜直接计数法成分方法方法生物技术与工程动物细胞培养_发酵工程细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交原理_原理膜的流动性细胞的全能性原理动物细胞融合原理主要应用_单克隆抗体制备核移植原理 _动物细胞工程胚胎工程受精精子的_卵母细胞培养到M期受精早期胚胎发育桑葚胚囊胚原肠胚主要时期胚胎移植胚胎分割最佳时期注意_建网络抓主干细胞增殖醋酸菌巴氏消毒法湿热灭菌法碳源、氮源、水、无机盐等稀释涂布平板法细胞的全能性膜的流动性细胞核的全能性桑葚胚、囊胚将内细胞团均等
2、分割获能选修三：生物技术与工程选修三：生物技术与工程转基因产品的安全性关注生殖性克隆人生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类生物技术与工程目的基因的筛选与获取_将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定基因工程工具限制酶、载体操作程序_改造现有蛋白质或产生新的蛋白质生物技术的安全性与伦理问题蛋白质工程操作对象结果基因DNA连接酶基因表达载体的构建发展发酵工程发酵工程传统传统发酵发酵技术技术项目项目毛酶毛酶乳酸菌乳酸菌酵母菌酵母菌醋酸菌醋酸菌生物学分类真核生物原核生物真核生物原核生物代谢类型异养需氧型异养厌氧型异养兼性厌氧型异养需氧型发酵条件需氧无氧前期需氧，后期不需氧一直需氧代谢产物蛋白质被
3、分解为小分子的肽和氨基酸，脂肪被分解为甘油和脂肪酸无氧呼吸产生乳酸有氧呼吸CO2和水，无氧呼吸酒精和CO2O2、糖源充足时，将糖分解成醋酸；O2充足、缺少糖源时，将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。发酵适宜温度1518 室温1830 3035 生产应用制作腐乳制作酸奶、泡菜酿酒、发面酿醋泡菜（天然乳酸菌，包括乳酸链球菌和乳酸杆菌）盐水浓度过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；盐水浓度过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质；温度偏高有害菌活动能力强；温度偏低，不利于乳酸发酵，导致发酵时间延长。果酒：发酵时先通气后密封的目的是：酵母菌是兼性厌氧菌，因此果酒发酵时先通气使酵母菌大量繁殖；后密封使酵母菌进行酒精发
4、酵。果醋：醋酸菌为好氧菌，需全程通气发酵工程基本环节发酵工程基本环节选育菌种从自然界筛选或诱变育种或基因工程扩大培养接种发酵罐内发酵分离提纯产物获得产品配制培养基灭菌选择培养基富集：促使菌体数量快速增长，满足发酵生产的需求代谢产物：根据产物的性质提取、分离和纯化菌体本身：过滤、沉淀单细胞蛋白是以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得的大量的微生物菌体。微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术培养基用途：培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。培养基的营养构成：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，此外还需要满足微生物生长对PH、特殊营养物质及O2的要求。例如：培养乳酸杆菌时
5、，需添加维生素；培养霉菌时，需将培养基调至酸性；培养细菌时，需将培养基调至中性或弱碱性。种类：物理性质划分液体培养基和固体培养基、半固体培养基。功能性质划分为选择培养基和鉴别培养基。琼脂培养基微生物的筛选方法：微生物的筛选方法：单菌落挑取法、选择培养法（选择培养出分解尿素的细菌）、鉴定培养法（鉴别某种细菌）。微生物的鉴别方法：微生物的鉴别方法：菌落特征鉴别法（形状、大小和颜色）、指示剂鉴别法（酚红指示剂变红，该微生物可分解尿素）、染色鉴别法（刚果红染色，出现透明圈说明该生物可分解纤维素）微生物筛选需根据被目标微生物的特性进行选择培养基的配置，比如以目标微生物可分解物为唯一碳源或氮源，也可配合鉴
6、别培养基一同进行筛选。选择培养基还可富集所需菌种，即扩大培养。无菌技术获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。包括消毒和灭菌。项目条件结果常用方法具体操作应用范围消毒较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法100煮沸5-6min日常用品巴氏消毒法62-65消毒30min或80-90处理30s-1min不耐高温的液体（牛奶等）化学药物消毒法用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线消毒法照射前配合喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可加强消毒效果接种室、接种箱、超净工作台灭菌强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法（充分燃烧层）酒精
7、灯外焰充分燃烧接种工具干热灭菌法160-170热空气中2-3h玻璃器皿、金属用具湿热灭菌(如：高压蒸汽灭菌法)100kpa，121，15-30min培养基及容器的灭菌微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术微生物的纯培养微生物纯培养包括：微生物纯培养包括：配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。酵母菌的纯培养：制备培养基(配制培养基、灭菌、)和分离酵母菌培养酵母菌(将接种后的平板和一个的平板倒置、培养)倒平板接种未接种设置培养基空白实验目的：对照，检测培养基是否被杂菌污染。注意点：培养基冷却至50摄氏度左右在酒精灯附近倒平板，边倒边轻微晃动。平板冷凝后
8、，要将平板倒置，原因是：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。平板划线法在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是：第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。在接种酵母菌的培养基上，观察到了不同形态的菌落，说明种不纯或无菌操作不规范接种的菌。灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。接种方法：接种方法：平板划线法（不能计数）和稀释涂布平板法；1、稀释涂布平板法（间接计数法）步骤：系列稀释（分散细胞），涂布平板计数原则：至少选择三块
9、平板；每块平板菌落数在30-300之间；计数公式：每克样品中的菌株数=（C/V)*M；C代表平板上生长的菌落数，V代表涂布时所用的稀释液体积（ml），M代表稀释倍数。计数结果：比实际偏小，原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。2、显微计数法（直接计数法）用计数板计数计数公式：每毫升原液所含菌株数=每小格内平均菌株数*400*104*稀释倍数计数结果：比实际偏大，原因：不能区分死菌与活菌。实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与土壤中分解尿素的细菌的分离与计数计数计数计数方法方法微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术原理：能分解尿素的细菌可以合成脲酶，脲酶能催化尿素分解产生N
10、H3,NH3可以作为细菌生长的氮源；因此以尿素为唯一氮源的培养基可分离能分解尿素的细菌。注：培养基中以尿素为唯一氮源，分离的微生物不一定是分解尿素的微生物，可能是硝化细菌，需加入酚红指示剂鉴别，如指示剂变红，则该菌可分解尿素。培养基中无氮源，可分离固氮微生物。例.产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是_(填编号)。编号物品培养基接种环培养皿涂布器灭菌方法高压蒸汽火焰灼烧干热臭氧(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经_后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取
11、0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌_个。梯度稀释4.6105(或460 000)(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行_育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以_为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径_的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。诱变脂肪较大植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交：植物体细胞杂交：植物细胞工程植物细胞工程原理：植物细胞的全能性，细胞内含有本物种全套遗传信息。关键激素：生长素与细胞分裂素影响细胞发育的方向。（脱分化和再分化时
12、的比例不同）口诀：先“生”分裂不分化，后“生”分裂又分化，同“使”分化频率高；“高”根，“低”芽，“中”愈伤诱导愈伤组织期间不需要光照原理：细胞膜的流动性，植物细胞的全能性；意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。遗传物质变化：若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，则杂交后的新植株应为异源四倍体，体细胞中染色体数为（2x+2y）条，4个染色体组，发生了染色体数目变异。高尔基体取材、消毒用流水充分冲洗外植体(幼嫩的茎段)；酒精擦拭双手和超净工作台；外植体的消毒：用体积分数70%酒精消毒30 s，然后立即用无菌水清洗23次；再用次氯酸
13、钠溶液处理30 min后，立即用无菌水清洗23次；用解剖刀将外植体切成0.51 cm长的小段接种将外植体的1/31/2插入诱导愈伤组织的培养基（勿倒插），诱导脱分化，长出愈伤组织（不需光照）转接将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上；长出芽后再转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗（需光照，诱导叶绿素的形成）移栽将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土愈伤组织：在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化，即失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块。关键激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分
14、化和再分化的关键因素。操作步骤：菊花的组织培养（实验）试管苗、次生代谢产物的培养：试管苗、次生代谢产物的培养：1、微型繁殖（快速繁殖）技术优点：高效、快速实现种苗的大量繁殖，保证优良品种的遗传特性。2、作物脱毒，获得脱毒苗取材：植物顶端分生区（如茎尖），原因：病毒极少或无病毒。不代表有抗毒性。3、单倍体育种操作流程：花药离体培养获得单倍体幼苗，经秋水仙素人工诱导染色体加倍，获得正常植株。优点：极大缩短了育种年限。4、诱变育种可选择愈伤组织阶段进行人工诱变，原因：愈伤组织细胞不断分裂，DNA复制时易发生基因突变。5、人工种子以植物组织培养得到的胚状体，不定芽、顶芽和腋芽等做为材料，包上人造种皮。
15、6、细胞产物的工厂化生产次生代谢产物的生产，通常在愈伤组织阶段培养。植物细胞工程的利用：植物细胞工程的利用：动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养条件培养条件：营养成分：除糖类、氨基酸、无机盐和维生素等细胞所需的营养物质外，通常还需加入血清等一些天然成分。无菌、无毒的环境：培养液需定期更换以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。适宜的温度、pH和渗透压气体环境：95%空气 5%CO2(维持培养液的pH)。动物细胞工程动物细胞工程原理：细胞增殖原代培养和传代培养区分：是否分瓶培养离心收集细胞分裂受阻细胞分裂受阻原因：细胞密度过大，有害代谢物积累过多，培养液中营养物质不足。贴壁生长的细
16、胞接触抑制。胚胎干细胞（ES细胞）：存在于早期胚胎（桑椹胚和囊胚期的内细胞团），具有全能性。成体干细胞：存在于成体组织或器官内（造血干细胞等），具有组织特异性，无全能性。诱导多能干细胞（iPS）：由体细胞经体外诱导分化形成，类似于胚胎干细胞。例：由病人自身体细胞诱导分化的ips细 胞在器官移植时不会发生免疫排斥反应干细胞种类干细胞种类通常选取成纤维细胞或干细胞原因：分裂能力强，易于培养。原代培养的细胞为10代以内的细胞，保持了正常的二倍体核型。动物细胞融合技术与单克隆抗体制备动物细胞融合技术与单克隆抗体制备克隆化培养和1.动物细胞融合动物细胞融合(1)原理：细胞膜具有一定的流动性；(2)方法：
17、PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等；(3)结果：形成杂交细胞；(4)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能；为制造单克隆抗体开辟了新途径。项目项目步骤步骤技术方法技术方法原理原理取材从已免疫的小鼠的脾脏中获取B淋巴细胞，体外培养骨髓瘤细胞动物细胞培养细胞增殖融合通过灭活病毒诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合动物细胞融合细胞膜的流动性选择第一次要从融合形成的杂交细胞中筛选出杂交瘤细胞选择培养基选择第二次要从杂交瘤细胞中获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞（96孔板每个孔只接种一个杂交瘤细胞）克隆化培养、抗体检测免疫学原理(抗原抗体特异性结合)培养在小鼠腹腔内进行体内培养，或在装有细胞培养
18、液的培养基中进行体外培养动物细胞培养细胞增殖杂交瘤细胞特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体2.单克隆抗体制备单克隆抗体制备动物体细胞核移植过程：动物体细胞核移植过程：受精过程：受精过程：获能M期卵细胞原核判断卵子是否受精的标志：。观察到两个极体或者雌、雄原核需要电刺激等方法激活重构胚动物体细胞核移植技术和动物克隆动物体细胞核移植技术和动物克隆原理：动物细胞核具有全能性。胚胎工胚胎工程程包括：体外受精、胚胎移植、胚胎分割体细胞核移植难于卵细胞核移植原因：体细胞分化程度大，恢复全能性较难。(1)过程：卵母细胞的采集(培养至M期)，精子的获取(要在体外进行获能处理-获得受精能力)，受精(2)意
19、义：体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施，还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。体外受精体外受精胚胎早期发育过程：胚胎早期发育过程：胚胎移植：胚胎移植：1、桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。胚胎分割胚胎分割：（无性生殖）：（无性生殖）3、设计试管婴儿比试管婴儿多出的是基因检测。2、卵裂期（有丝分裂）胚胎发育过程中，有机物不断减少，DNA不断增加，细胞数目增多，细胞体积减小。项目项目试管婴儿试管婴儿设计试管婴儿设计试管婴儿不同点过程无图中d过程多出图中d过程技术手段无须进行遗传学诊断进行遗传学诊断应用主要解决不孕夫妇的生育问题主要用于白
20、血病、贫血症等遗传疾病的预测及治疗相同点二者都是体外受精、体外进行早期胚胎培养，再经过胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程如图所示(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点比较试管婴儿和设计试管婴儿基因工程理论基础：基因工程理论基础：基因工程的基因工程的3种基本工具：种基本工具：1、限制酶主要来自于原核生物；为什么不能切割自己的DNA分子？限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。2、常用载体：质粒（一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。）图解图解限制酶的
21、选择原则限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst，而不选择Sma。(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst和EcoR两种限制酶。1.目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞或获得预期等的基因。(2)筛选合适的目的基因根据已知结构和功能进行筛选。利用序列数据库和
22、序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取获取目的基因。性状表达产物构建基因文库利用PCR获取和扩增目的基因DNA半保留复制2种引物耐高温的DNA聚合酶单链耐高温的DNA聚合酶指数琼脂糖凝胶电泳包括基因组文库和cDNA文库（或（或Taq 酶）、酶）、缓冲液缓冲液（含（含Mg2+）注注：1、引、引物是一小段能与物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对母链的一段碱基序列互补配对的短单链的短单链核酸，长度约为核酸，长度约为20-30个核苷酸；个核苷酸；2、需已知目的基因的一部分核苷酸序列；、需已知目的基因的一部分核苷酸序列；3、扩增方向：、扩增方向：5-3端。端。cDNA?通过mRNA逆转录，
23、需mRNA逆转录酶基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心(1)目的：使目的基因，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代启动子标记基因(3)构建过程内含子：不能编码蛋白质的序列，原核生物无，大内含子：不能编码蛋白质的序列，原核生物无，大多数真核生物转录后会在加工中去除多数真核生物转录后会在加工中去除 外显子：可以编码蛋白质的序列外显子：可以编码蛋白质的序列真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区具有调控作用，上游有启动子，下游有终止子具有调控作用，
24、上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子复制原点复制原点：载体自我复制的起点3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法 农杆菌转化法、_显微注射法 处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA中农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）基因表达载体导入花粉管通道法Ca24.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测水平检测目的检测方法分子水平目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上_、分子杂交技术目的基因是否转录出了mRNA目的基因是否翻译出蛋白质_个体水平转基因生物是否表现出相应的特性及表现程度如抗虫、抗病的接种实验 PCR抗原抗体杂交乳腺生物反应器：乳腺生物反应器：将药用蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。该转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产所需要的药物。蛋白质工程：蛋白质工程：基因工程和蛋白质工程应用基因工程和蛋白质工程应用基因修饰或合成DNA粗提取与鉴定粗提取与鉴定DNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定
