1、蛋白质相互作用蛋白质相互作用研究方法研究方法王心宇王心宇College of Life Sciences1最新课件1 研究蛋白质相互作用的意义研究蛋白质相互作用的意义 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学proteomicsproteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactomeinteractome的研究就成为蛋白质组学中最主
2、要研究内容之一。2最新课件2 蛋白质相互作用常用研究方法蛋白质相互作用常用研究方法1 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)2 pull-down3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)5 Far-western analysis3最新课件3 酵母双杂交技术酵母双杂交技术3.1 原理原理DNA-binding and activating functions in a transcription fac
3、tor may comprise independent domains of the protein.4最新课件The two hybrid technique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcription-activating domain.5最新课件3.2 酵母双杂交文库构建与筛选酵母双杂交文库构建与筛选BD Matchm
4、aker Library Construction&Screening Kits6最新课件诱饵蛋白载体构建诱饵蛋白载体构建7最新课件8最新课件pGADT7-Rec Vector Information9最新课件文库构建文库构建10最新课件11最新课件Constructing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast.12最新课件cDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in yeast13最新课件Yeast cells that are mating.
5、A zygote typically has three-lobed shape,the lobes representing the two haploid(parental)cells and the budding diploid cells.Library screening by mating14最新课件Positive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal15最新课件检测特定两个蛋白是否互作检测特定两个蛋白是否互作16最新课件pGADT7 Vector Information17最新课件3.3 膜蛋白互作研究方法膜蛋白
6、互作研究方法基于泛素的酵母双杂交基于泛素的酵母双杂交体系体系(mating-based Split ubiquitin system mbSUS“)1）GAL4体系的缺点体系的缺点2)MbSUS 体系体系18最新课件mbSUS 原理原理19最新课件20最新课件In vivo cloning into mbSUS vectorsGATEWAY cloning method21最新课件22最新课件23最新课件24最新课件25最新课件26最新课件27最新课件28最新课件4 pull down1)原理原理29最新课件30最新课件2)试剂盒试剂盒31最新课件The MagneGST.Pull-Down
7、System32最新课件Figure 1.Overview of the MagneGST.Pull-Down System protocol.P=Prey Protein,M=MagneGST.Particle.33最新课件5 免疫共沉淀免疫共沉淀Co-IP34最新课件35最新课件36最新课件6 Far-western analysis37最新课件 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告
8、基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。7 双分子荧光互补技术双分子荧光互补技术 BiFCBiFC38最新课件Principle of the BiFC assay39最新课件GFPGFP的特性的特性 绿色荧光
9、蛋白(GFP)来源于水母(Aequorea victoria)，分子质量约为27 kda，能在各种细胞中表达.受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体中发出绿色荧光.1992 年，Prasher 等2克隆了GFP 基因.随后，GFP 作为一种研究基因表达和蛋白质定位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到了广泛的应用.40最新课件GFP 的一些定点突变能明显地改变其波长性质.产生的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66 位的酪氨酸突变为色氨酸酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的苏氨酸突变为酪氨酸后成黄色荧光
10、蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)，145 位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成蓝色荧光蛋白(blue fluorescence protein，BFP)3.2002 年Hu 等1 最先报道了用BiFC技术在活细胞中观察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP 作标记，在荧光显微镜下用525 nm 波长直接检测黄色荧光.41最新课件GFP及其各种突变体的片段互补特性及其各种突变体的片段互补特性42最新课件Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecul
11、ar fluorescence complementation43最新课件Detection of proteinprotein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementationDepartment of Plant Sciences,Tel Aviv University,Tel Aviv 69978,Israel44最新课件Confocal images of bimolecular fluorescence complementation(BiFC)studies45最新课件IPG735+PG73646最新课件IPG735+PG73647最新课件Ppn20-735+PG73648最新课件Ppn20-735+PG736,蛋白互作可能导致internalization49最新课件多色荧光多色荧光互补技术互补技术50最新课件
