1、NGS系列讲座（一）NGS简介及原理2017/06/01魏冬凯Outline二代测序技术背景Solexa测序原理2ppt课课件件Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他平台测序技术简介3ppt课课件件什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。百度百科测序主要研究的是DNA一级结构，不涉及DNA的二级、三级结构4ppt课课件件DNA合成的基本过程dNTPddNTP5ppt课课件件一代测序末端终止法末端终止法（ABI 37
2、00）使用特异性引物与单链模板使用特异性引物与单链模板DNA退火，在退火，在DNA聚合酶作用下进聚合酶作用下进行延伸反应，用行延伸反应，用ddNTP终止，用荧光染料标记终止，用荧光染料标记4种不同的碱基种不同的碱基，通过通过计算机自动读出。计算机自动读出。Frederick“Fred”Sanger6ppt课课件件Sanger测序5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerA C G C G C C G G G T?A C G C G C C G G G T?537ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C
3、 A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 535T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T8ppt课课件件Sanger 测序G T C T T G G G C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G C CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A
4、 C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 535T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp9ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A
5、T C G C G 53G T C T T G G G C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G C C5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C AG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp26 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A10
6、ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 53G T C T T G G G C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G C C5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C AG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C
7、 C C A21 bp26 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A22 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG G11ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 53G T C T T G G G
8、C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G C C5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C AG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp26 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A22 bp5T G C G C G G C C C AT G C G
9、C G G C C C A G G12 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG T C T T G G G G T C T T G G G C C12ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 53G T C T T G G G C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G C C5T G C G C
10、G G C C C AT G C G C G G C C C AG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp26 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A22 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G G12 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C
11、G G C C C A G T C T T G G G G T C T T G G G C C20 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C APrimerG T C T G T C T T T13ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 53G T C T T G G G C T A G C G G T C T T G G G C T A G C G
12、C C5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C AG T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp26 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A22 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G G12 bp5T G C G C G G C C
13、 C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G G T C T T G G G C C20 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T G T C T T T16 bp14ppt课课件件Sanger 测序A C G C G C C G G G T?A C G C G C C G G G T?53?C C5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A?T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp26
14、bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A?A A22 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G G12 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A?C C20 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A?T T16 bp15ppt课课件件5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G T C T T G G G G19 bp5
15、T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T G T C T T G G G C T A A22 bpSanger 测序G T C T T G G G C G T C T T G G G C T T5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A21 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G G G T C T T G G G C C20 bp5T G C G C G G C C C AT G C G
16、 C G G C C C A G G12 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G G T T13 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T G T C T T T16 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T G T C C14 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C G T C T T15 bp5T G C G C G G C C C AT G C G
17、 C G G C C C A G T C T T G T C T T G G17 bp5T G C G C G G C C C AT G C G C G G C C C A G T C T T G G T C T T G G G18 bpLaser Reader16ppt课课件件Sanger 测序17ppt课课件件Sanger测序的特点l测序长度500-1000bp。l通量低，每次测序最多获得1kb数据，如果测大基因组，成本极高。l错误率高，PCR带来错配。l测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。18ppt课课件件1990 年 10 月美国确定把当
18、年的 10 月 1 日作为官方实施 HGP 的起始日期，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。2000年完成草图，2003年正式完成。全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因。目前已经发现和定位了26000多个功能基因。耗时13年，30亿美金。人类基因组计划（HGP）19ppt课课件件1977年年2005年年Roche 4542006年年Illumina GA2007年年ABI solid2008年年Helicos 单分子测序仪单分子测序仪2009年年Pacific 单分子测序仪单分子测序仪第一代第一代第二代第二代第三代第三代二代测序技术的出现20ppt课课
19、件件鸟枪法基因组基因组片段21ppt课课件件鸟枪法基因组片段通过剪切力，超声，酶切等打断基因组22ppt课课件件ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT17 bp66 bp基本测序思路23
20、ppt课课件件ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基
21、因组:基本测序思路24ppt课课件件ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCG
22、AAATGGCTCC基因组:基本测序思路25ppt课课件件Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他二代测序平台技术简介26ppt课课件件Solexa测序的关键技术（Illumina）桥式PCR(Solid-phase bridge amplification)27ppt课课件件O PPPHNNOO荧光基团3保护基团Next cycle掺入检测去保护基团 去荧光基团ODNAHNNOO3O5游离3末端XOH4种标记过的核苷酸可逆终止反应Reversible Terminator ChemistrySolexa测序的关键技术（Illumina）28ppt课课件件桥式PCR29ppt课课
23、件件准备DNA片段两端接上 adapters桥式PCR30ppt课课件件准备DNA片段两端接上 adapters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20 micronsSequence桥式PCR31ppt课课件件CAGTCATCACCTAGCGTA5GTCAGTCAGTCAGT35First base incorporatedCycle 1:Add sequencing reagentsDetect SignalCleave Terminator and DyeCycle 2-n:Add sequencing reagents and repeat边合成边
24、测序(Sequencing By Synthesis)32ppt课课件件SBS123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列33ppt课课件件Solexa测序原理34ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)35ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)36ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)37ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)38ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)39ppt课课件件测序种类Single-Read Sequencing(SR)Paired-End Sequencing(PE)Index Sequencing(PE)40ppt课课件件Question41ppt课课件件谢谢！42ppt课课件件
