1、1本章重点与难点 细菌感染性标本的采集原则细菌感染性标本的采集原则 细菌感染的实验室检验程序细菌感染的实验室检验程序 常用的血清学诊断方法常用的血清学诊断方法 适应性免疫的获得方式适应性免疫的获得方式 人工免疫的概念和常用的免疫制剂人工免疫的概念和常用的免疫制剂 细菌感染的治疗原则细菌感染的治疗原则2第一节第一节 细菌感染的实验诊断细菌感染的实验诊断3细菌感染的实验室检验方法细菌感染的实验室检验方法4一一.临床标本的采集与运送原则临床标本的采集与运送原则早期采集早期采集无菌操作无菌操作 选感染部位选感染部位最佳时间采集最佳时间采集双份血清双份血清 标本采集标本采集 做好标记做好标记置于密闭容器
2、内置于密闭容器内尽快送检尽快送检标本运送标本运送 5（一）细菌的形态学检查（一）细菌的形态学检查暗视野暗视野显微镜显微镜相差相差显微镜显微镜主要用于检查在生活状态下主要用于检查在生活状态下细菌的动力及其运动情况细菌的动力及其运动情况不染色不染色标本标本二、细菌的检测二、细菌的检测细菌的染色细菌的染色革兰革兰染色染色抗酸抗酸染色染色荧光金胺荧光金胺O O染色染色其他其他特殊染色特殊染色7革兰染色革兰染色葡萄球菌（革兰染色阳性葡萄球菌（革兰染色阳性）大肠埃希菌（革兰染色阴性大肠埃希菌（革兰染色阴性）8细菌检查的一般程序细菌检查的一般程序标本标本脓脓/痰痰/尿尿血、脑血、脑脊液等脊液等涂片、染色、镜
3、检涂片、染色、镜检分离培养分离培养纯培养纯培养生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定药敏试验药敏试验动物实验动物实验增菌增菌(二二)细菌分离培养与鉴定细菌分离培养与鉴定9细菌的分离培养细菌的分离培养 培养基的成分培养基的成分 pH 培养时间培养时间 温度温度 气体环境气体环境在血平板上的肺炎链球菌菌落在血平板上的肺炎链球菌菌落10生化试验生化试验 肠道感染细菌在含铁双糖培养基上的生化反应肠道感染细菌在含铁双糖培养基上的生化反应11血清学鉴定血清学鉴定 利用已知的特异性抗体检查未知的纯培养细菌利用已知的特异性抗体检查未知的纯培养细菌 对细菌进行种、群、型的鉴定对细菌进行种、群、型的鉴定沙门菌血清学
4、鉴定沙门菌血清学鉴定摘自摘自 临床微生物检验临床微生物检验（第五版）人民卫生出版社（第五版）人民卫生出版社12药物敏感试验药物敏感试验 纸片扩散法、稀释法、纸片扩散法、稀释法、E-test法法 最低抑菌浓度（最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）能够完全抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度能够完全抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度 最低杀菌浓度（最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）能够杀死培养基中细菌的最低药物浓度能够杀死培养基中细菌的最低药物浓度13纸片扩散法纸片扩散法含有定量抗生素的纸片
5、贴在已接种待检病原菌含有定量抗生素的纸片贴在已接种待检病原菌的琼脂平板上，纸片上的抗生素向周围琼脂中扩散，的琼脂平板上，纸片上的抗生素向周围琼脂中扩散，形成了逐渐减小的药物浓度梯度。由于致病菌对各形成了逐渐减小的药物浓度梯度。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现抑制病原菌生长而形成的大小不同的抑菌环。根据抑制病原菌生长而形成的大小不同的抑菌环。根据抑菌环的有无和大小来判定试验菌对该抗菌药物耐抑菌环的有无和大小来判定试验菌对该抗菌药物耐药或敏感。药或敏感。14稀释法稀释法 以一定浓度的抗菌药物与含有待检细菌的以一定浓度的抗菌药物与
6、含有待检细菌的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。度。稀释法稀释法 琼脂稀释法琼脂稀释法使用琼脂培养基使用琼脂培养基 肉汤稀释法肉汤稀释法使用肉汤培养基使用肉汤培养基 15抗生素连续梯度法（抗生素连续梯度法（E-test法）法）将稀释法和扩散法的原理相结合，使用预先设将稀释法和扩散法的原理相结合，使用预先设定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度，采用琼脂培定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度，采用琼脂培养基培养以确定不同抗菌药物对微生物的最低抑菌养基培养以确定不同抗菌药物对微生物的最低抑菌浓度
7、（浓度（MIC）。）。16将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液，放入自动微将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液，放入自动微生物鉴定及药敏分析系统中，通过计算机自动扫描、读数、生物鉴定及药敏分析系统中，通过计算机自动扫描、读数、分析、最后报告鉴定及药敏结果。分析、最后报告鉴定及药敏结果。摘自摘自 临床微生物检验临床微生物检验（第五版）人民卫生出版社（第五版）人民卫生出版社17自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统药敏检测原理药敏检测原理微型化的肉汤稀释试验微型化的肉汤稀释试验根据根据CLSI标准得到相标准得到相应敏感度
8、：敏感、中度应敏感度：敏感、中度敏感和耐药敏感和耐药微生物数码鉴定原理微生物数码鉴定原理计算并比较数据库内每计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率个生化反应出现的频率总和总和性能特点性能特点自动化程度较高、检测速度自动化程度较高、检测速度快、可鉴定细菌种类及药敏快、可鉴定细菌种类及药敏试验种类多、数据处理软件试验种类多、数据处理软件功能强大、结果准确可靠功能强大、结果准确可靠系统组成系统组成测试卡（板）、菌液测试卡（板）、菌液接种器、培养和监测接种器、培养和监测系统、数据管理系统系统、数据管理系统自动微生物鉴自动微生物鉴定及药敏分析定及药敏分析系统系统
9、1818（三）细菌抗原的检测（三）细菌抗原的检测凝集试验凝集试验用已知抗体检测待检标本中未知的颗粒性抗原。用已知抗体检测待检标本中未知的颗粒性抗原。IgG的的Fc段与金葡菌的段与金葡菌的SPA结合，结合，Fab段与细菌抗原段与细菌抗原结合后，可使金葡菌发生肉眼可见的凝集现象。结合后，可使金葡菌发生肉眼可见的凝集现象。协同凝集试验协同凝集试验用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原，借用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原，借助荧光显微镜观察。助荧光显微镜观察。免疫荧光技术免疫荧光技术对流免疫电泳对流免疫电泳利用双向琼脂扩散与电泳技术相结合的方法。由于电泳利用双向琼脂扩散与电泳技术相结合的方法
10、。由于电泳和电渗作用，抗原向正极移动，抗体向负极移动，在比和电渗作用，抗原向正极移动，抗体向负极移动，在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线。例合适处形成肉眼可见的沉淀线。用酶标记的抗体检测特异性可溶性抗原的实验技术。用酶标记的抗体检测特异性可溶性抗原的实验技术。酶免疫技术酶免疫技术19PCR（含（含RT-PCR、real time PCR等）等）核酸杂交核酸杂交技术技术基因芯片基因芯片技术技术16S rRNA基因序列基因序列分析分析（四）细菌核酸的检测（四）细菌核酸的检测20（五）生物芯片技术（五）生物芯片技术将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织等生物
11、样品有序地固定于硅片、尼细胞及组织等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上，在一定的条件下进行生龙膜等固相支持物上，在一定的条件下进行生化反应。用化学荧光法、酶标法或同位素法显化反应。用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果，通过特定的仪器读取与收集数据，示反应结果，通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据分析，从而判断样品中靶分并用软件进行数据分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。子的种类和数量。21三、细菌感染的血清学诊断三、细菌感染的血清学诊断l用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清或其他体液中的抗体及其效价的变化，可以或其他体液中
12、的抗体及其效价的变化，可以作为感染性疾病的辅助诊断。作为感染性疾病的辅助诊断。l由于本实验多采取病人血清检测抗体，故常由于本实验多采取病人血清检测抗体，故常称为血清学诊断（称为血清学诊断（serological diagnosis）。）。l一般适用于抗原性较强的细菌，以及病程较一般适用于抗原性较强的细菌，以及病程较长的感染性疾病。也可用于调查人群对某病长的感染性疾病。也可用于调查人群对某病原菌的免疫应答水平以及检测疫苗接种后的原菌的免疫应答水平以及检测疫苗接种后的预防效果。预防效果。22细菌性感染的血清学诊断细菌性感染的血清学诊断血清学试验血清学试验疾病举例疾病举例直接凝集反应直接凝集反应肥达
13、试验、外斐试验肥达试验、外斐试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌沉淀试验沉淀试验梅毒梅毒间接免疫荧光技术间接免疫荧光技术各类微生物感染各类微生物感染补体结合试验补体结合试验Q热热中和试验中和试验风湿热（抗风湿热（抗O试验）试验）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验各类微生物感染各类微生物感染23第二节第二节 细菌感染的特异性预防细菌感染的特异性预防24机体获得特异性免疫力的方式机体获得特异性免疫力的方式自然免疫自然免疫人工免疫人工免疫u主动免疫：疫主动免疫：疫苗或类毒素等苗或类毒素等u被动免疫：抗被动免疫：抗毒素或丙种球蛋毒素或丙种球蛋白等白等u主动免疫
14、：隐主动免疫：隐性或显性感染性或显性感染u被动免疫：获被动免疫：获得母体的得母体的Ab(胎胎盘盘/初乳初乳)25一、人工主动免疫一、人工主动免疫人工主动免疫（人工主动免疫（artificial active immunization）是）是将疫苗或类毒素接种于人体，刺激机体免疫系统产生特将疫苗或类毒素接种于人体，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，机体主动产生获得性免疫力的一种防治异性免疫应答，机体主动产生获得性免疫力的一种防治微生物感染的措施，主要用于特异性预防。微生物感染的措施，主要用于特异性预防。采用人工主动免疫方法通常称为预防接种采用人工主动免疫方法通常称为预防接种（prophylac
15、tic inoculation）或疫苗接种（）或疫苗接种（vaccination）。）。特异性预防特异性预防疫苗疫苗类毒素类毒素26疫苗的种类疫苗的种类 死疫苗：伤寒疫苗、霍乱疫苗死疫苗：伤寒疫苗、霍乱疫苗 活疫苗（减毒活疫苗）：卡介苗（活疫苗（减毒活疫苗）：卡介苗（BCG）亚单位疫苗：肺炎链球菌荚膜多糖亚单位疫苗：肺炎链球菌荚膜多糖 基因工程疫苗基因工程疫苗 载体疫苗载体疫苗 核酸疫苗核酸疫苗27活疫苗与死疫苗的比较活疫苗与死疫苗的比较区别点区别点活疫苗活疫苗死疫苗死疫苗制品特点制品特点减毒或无毒的疫苗减毒或无毒的疫苗死菌，仍保持免疫原性死菌，仍保持免疫原性制备方法制备方法通过非正常培养减毒
16、株通过非正常培养减毒株通过物理化学方法使病原体失活通过物理化学方法使病原体失活接种次数和接种量接种次数和接种量1次，量小次，量小23次，量大次，量大接种反应接种反应可在体内增殖，类似轻型可在体内增殖，类似轻型感染或隐性感染感染或隐性感染在体内不增殖，可出现发热、全在体内不增殖，可出现发热、全身或局部肿痛等反应身或局部肿痛等反应免疫的类型免疫的类型体液免疫和细胞免疫体液免疫和细胞免疫体液免疫体液免疫免疫效果免疫效果15年年0.51年年毒力回升与安全性毒力回升与安全性有可能，对免疫缺陷者有有可能，对免疫缺陷者有危险危险不可能，安全性好不可能，安全性好疫苗的稳定性疫苗的稳定性相对不稳定相对不稳定相对
17、稳定相对稳定保存保存不易保存，不易保存，4存活存活2周，周，真空冻干可长期保存真空冻干可长期保存易保存，易保存，4可保存可保存1年以上年以上28新型疫苗新型疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗基因工程疫苗基因工程疫苗核酸疫苗核酸疫苗 重组载体疫苗重组载体疫苗29二、人工被动免疫二、人工被动免疫人工被动免疫（人工被动免疫（artificial passive immunization）是输入含有特异性抗体的）是输入含有特异性抗体的免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力的过程，可用于某些急性传染病的紧
18、疫力的过程，可用于某些急性传染病的紧急预防和治疗。急预防和治疗。30两种人工免疫方法的比较两种人工免疫方法的比较区别点区别点人工主动免疫人工主动免疫人工被动免疫人工被动免疫免疫物质免疫物质抗原抗原抗体或细胞因子等抗体或细胞因子等接种次数接种次数13次次1次次免疫出现时间免疫出现时间慢（注射后慢（注射后24w）快（注射后立即出现）快（注射后立即出现）免疫维持时间免疫维持时间长（数月数年）长（数月数年）短（短（23w）用途用途多用于预防多用于预防多用于治疗多用于治疗或或紧紧急急预防预防31第三节第三节 细菌感染的治疗原则细菌感染的治疗原则32 主要采用抗菌药物来治疗细菌感染。主要采用抗菌药物来治疗
19、细菌感染。抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物以及由微生物合成的抗生素类药物。以及由微生物合成的抗生素类药物。正确合理应用抗菌药物是提高疗效、降低不良正确合理应用抗菌药物是提高疗效、降低不良反应发生率以及减少或减缓细菌耐药性发生的反应发生率以及减少或减缓细菌耐药性发生的关键。关键。33抗菌药物治疗性应用的基本原则抗菌药物治疗性应用的基本原则 诊断为细菌性感染者，方有指征应用抗菌药物；诊断为细菌性感染者，方有指征应用抗菌药物；尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物敏感试验结果选用抗菌药物；敏感试验结果选用抗菌药
20、物；按照药物的抗菌作用特点及其体内过程特点选按照药物的抗菌作用特点及其体内过程特点选择用药；择用药；抗菌药物治疗方案应综合患者病情、病原菌种抗菌药物治疗方案应综合患者病情、病原菌种类及抗菌药物特点制订。类及抗菌药物特点制订。34复习思考题复习思考题1.取脑脊液进行细菌感染的检查，用什么免疫学方法可以进取脑脊液进行细菌感染的检查，用什么免疫学方法可以进行快速诊断？行快速诊断？2.检查病原菌抗原和血清中的特异性抗体选用的免疫学方法检查病原菌抗原和血清中的特异性抗体选用的免疫学方法相同吗？为什么？相同吗？为什么？3.自动微生物鉴定和药敏分析系统的原理和特点是什么？自动微生物鉴定和药敏分析系统的原理和特点是什么？4.若检测细菌核酸，可选择的实验方法有哪些？其原理与特若检测细菌核酸，可选择的实验方法有哪些？其原理与特点是什么？点是什么？5.紧急预防细菌感染时应采用的方法是什么？为什么？紧急预防细菌感染时应采用的方法是什么？为什么？35
