1、上海丰汇生物研究有限公司上海丰汇生物研究有限公司化学发光介绍化学发光介绍发光免疫技术发光免疫技术发光免疫技术发光免疫技术(luminescence immunoassay,LIA)是是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性度特异性,而且还具有分离简便而且还具有分离简便,可以实现自可以实现自动化分析特点动化分析特点,使之成为医学、生物学研究使之成为医学、生物学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。领域中一种新的
2、重要的免疫学分析手段。发光与化学发光剂一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光释放出的能量表现为光的发射，称为发光(luminescence)。根据形成激发态分子的激根据形成激发态分子的激发能可将发光分为三种类型发能可将发光分为三种类型:1.光照发光光照发光 2.生物发光生物发光 3.化学发光。化学发光。1.光照发光光照发光发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光当回复至基态时发出较长波长的可见光。电子e光子基态能级2.生物发光生物发光典型例子为萤火虫
3、发光。反应底物为萤火典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素虫荧光素(firefly luciferin)，在荧光素酶在荧光素酶(luciferase)的催化下利用的催化下利用ATP产能，生成产能，生成激发态的氧化萤火虫荧光素激发态的氧化萤火虫荧光素(oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。式放出。3.化学发光化学发光化学发光是在常温下经化学反应所产生的化学发光是在常温下经化学反应所产生的发射光。发射光。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物某些化合物(发光剂或发光底物发光剂或发
4、光底物)可以利用一可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量射光子的形式释放能量(即发光即发光)。化学发光免疫技术中常用的化学化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物发光剂或发光底物 酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 直接化学发光剂直接化学发光剂 电化学发光剂电化学发光剂 1酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而
5、发出光的一类发光底物，目前化学发光酶发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（和碱性磷酸酶（ALP），），相应发相应发光底物为：光底物为：HRP的发光底物的发光底物：价格低廉、国内技术成：价格低廉、国内技术成熟熟 ALP的发光底物的发光底物：价格昂贵、国内无成熟：价格昂贵、国内无成熟技术技术(1)HRP的发光底物的发光底物 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺或其衍生物鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行。性缓冲液中进行。（2）ALP的发光底物
6、的发光底物常用的底物为常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷-4-甲氧基甲氧基-4-甲基甲基-4-（3-磷酸氧基）磷酸氧基）-苯基苯基-1，2-二氧乙二氧乙烷（烷（AMPPD）和）和4-甲基伞形酮磷酸盐（甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。，荧光底物）。AMPPDAMPPD在碱性条件下，被在碱性条件下，被ALP酶解生成相酶解生成相当稳定的当稳定的AMP-D阴离子，其有阴离子，其有2-30min的分的分解半衰期，发出波长为解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，的持续性光，在在15min时其强度达到高峰，时其强度达到高峰，15 60min内内光强度保持相对稳定。光强度保持相对稳定。2
7、直接化学发光剂直接化学发光剂这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯等条件就能发光，如吖啶酯（acridinium,AE）在含过氧化氢的稀碱溶）在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。液中即能发光。3.电化学发光剂电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌的物质。化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+（图（图19-1）和电子供体三丙胺（）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。电极表面可同时失去一个电子而发生
8、氧化反应。二价的二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，成为强氧被氧化成三价，成为强氧化剂，化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基），形成自由基TPA.，成为一种很强的，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的Ru(bpy)33+使其形成激发态的使其形成激发态的Ru(bpy)32+.。3.电化学发光剂电化学发光剂激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为一个波长为620nm的光
9、子，回复到基态的的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增复始地进行，产生许多光子，使光信号增强强。酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。测定而直接进行定量。酶促化学发光免疫分析（双抗体夹心法）化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免技术（技术（EIA）、放免技术（）、放免技术（RIA）、荧光免）、荧光免疫技术（疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术）和
10、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。）之后发展的一项新兴测定技术。化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。其起步于其起步于80年代初，快速发展于年代初，快速发展于90年代，年代，在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃发展的阶段。发展的阶段。化学发光免疫技术具备以下特点化学发光免疫技术具备以下特点：高度敏感，极限达高度敏感，极限达10-1710-19M/L，远高于
11、，远高于RIA、EIA、TRFIA。特异性强，重复性好特异性强，重复性好C.V.10。测定范围宽，可达测定范围宽，可达7个数量级。个数量级。试剂稳定性好，无污染有效期试剂稳定性好，无污染有效期612月。月。操作简单，易于自动化。操作简单，易于自动化。在对环保很重视的国家，在对环保很重视的国家，CLIA成了取代成了取代RIA的首的首选方法。选方法。化学发光原理化学发光原理 化学发光检测主要是借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。化学发光反应基本原理化学发光反应基本原理超顺磁珠化学发光的应用化学发光的应用传染性疾病的检测：传染性疾病的检测：H
12、BsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等等甲状腺功能检测：甲状腺功能检测：TT3、TT4、T3、T4、TSH糖尿病检测：糖尿病检测：INS、C-P等等肿瘤标志物检测：肿瘤标志物检测：AFP、CEA、PSA、fPSA、NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等等性腺激素检测：性腺激素检测：E2、Testo、Prog、PRL、FSH、LH、HCG 等等各品牌对比各品牌对比类别丰汇雅培罗氏贝克曼方法学检测试剂1.酶促化学发光2.纯液相反应3.通用型纳米免疫磁珠4.亲和素-生物素免疫放大系统5.成熟的增强型鲁米诺发光体系1.吖啶酯直接化学发
13、光2.半液相反应3.非通用型磁珠，磁珠上标记抗体（抗原）1.电化学发光2.纯液相反应3.通用型纳米免疫磁珠4.亲和素-生物素免疫放大系统1.酶促化学发光2.纯液相反应3.通用型纳米免疫磁珠4.亲和素-生物素免疫放大系统5.碱性磷酸酶发光体系仪器性能及参数自动化程度真正的全自动无人伺候真正的全自动无人伺候真正的全自动无人伺候真正的全自动无人伺候检测速度单机检测速度最快一步法：恒速400test/h；两步法：恒速200test/h，自测试开始第16.5分钟出第一个测试结果，以后每隔9秒出一个结果最高速度200 test/h最高速度180 test/h100 test/h操作模式随机检测，急诊插入功
14、能随机检测，急诊插入功能随机检测，急诊插入功能随机检测，急诊插入功能反应杯120个永久性免维护反应杯一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高各品牌对比各品牌对比(续上表）续上表）丰汇雅培罗氏贝克曼仪器性能及参数加样方式四智能加样手，各试剂独立加样，杜绝交叉污染智能加样手智能加样手智能加样手试剂位83个，超大独立冷藏双试剂盘独立冷藏试剂位独立冷藏试剂位独立冷藏试剂位孵育方式金属浴，温度控制随意可调，精度达0.1度金属浴金属浴金属浴搅拌方式双独立搅拌手单独立搅拌手单独立搅拌手单独立搅拌手可用方法学夹心法、竞争法、间接法、特殊方法学可随机编辑夹心法、竞争法、间接法夹心法、竞争法、
15、间接法夹心法、竞争法、间接法最小反应体积100ul200ul200ul200ul检测方法单光子计数单光子计数单光子计数单光子计数灵敏度10pg/ml10pg/ml10pg/ml10pg/ml一次性耗材无有5元/test有5元/test有5元/test丰汇化学发光测定仪丰汇化学发光测定仪磁 力 清 洗 站十 二 步 清 洗 工 作 站独 立 的 搅 拌 系 统独创永 久 性 反 应 装 置高精密度单光子计数系统高精密度微量加样系统精 准 的 加 样 手 系 统丰汇全自动液相化学发光检测系统丰汇全自动液相化学发光检测系统具有完全自主知识产权；具有完全自主知识产权；速度快：全球最快的全自动化学发光，
16、最速度快：全球最快的全自动化学发光，最高恒速可达高恒速可达600test/小时，目前雅培小时，目前雅培i2000理理论速度为论速度为200test/小时实际速度为小时实际速度为165test/小小时左右；罗氏的电化学发光理论速度为时左右；罗氏的电化学发光理论速度为180test/小时，实际速度小时，实际速度150test/小时左右；小时左右；全球首创永久性反应杯：无一次性耗材全球首创永久性反应杯：无一次性耗材（如一次性反应杯、（如一次性反应杯、TIP头等），大大节省头等），大大节省用户成本。用户成本。独到、灵巧的暗室设计结构为快速独到、灵巧的暗室设计结构为快速、准确、准确检测反应结果创造了有利
17、条件；检测反应结果创造了有利条件；采用高灵敏度的采用高灵敏度的PMT（光电倍增管）检测（光电倍增管）检测系统。可以达到快速检测，检测结果稳定，系统。可以达到快速检测，检测结果稳定，灵敏度高，设备运行无成本维护；灵敏度高，设备运行无成本维护；样品针采用特殊清洗方式，杜决交叉污染；样品针采用特殊清洗方式，杜决交叉污染；独立的磁珠试剂搅拌工作站，磁珠试剂分独立的磁珠试剂搅拌工作站，磁珠试剂分布更加均匀，杜绝交叉污染；布更加均匀，杜绝交叉污染；维护成本低、无一次性耗材，采用永久反维护成本低、无一次性耗材，采用永久反应杯，无需更换；应杯，无需更换；操作简单方便，检测速度快，大大减小医操作简单方便，检测速度快，大大减小医护工作者的劳动强度；护工作者的劳动强度；仪器成本适中，适合各级别医院使用，市仪器成本适中，适合各级别医院使用，市场潜力巨大；场潜力巨大；上海丰汇上海丰汇
