1、中药化学的实验基本技能中药化学的实验基本技能一、概述一、概述v分离并鉴定单体化合物是中药化学的实验的分离并鉴定单体化合物是中药化学的实验的基本要求，也是进一步进行其它相关实验的基本要求，也是进一步进行其它相关实验的基础。主要包括分离和鉴定两个步骤。基础。主要包括分离和鉴定两个步骤。v常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶、树脂、凝胶或氧谱。我们常用的是以硅胶、树脂、凝胶或氧化铝作固定相的吸附或分配色谱柱。由于柱化铝作固定相的吸附或分配色谱柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些
2、心得，希望能有所帮助。柱的体会写些心得，希望能有所帮助。二、柱层析分离二、柱层析分离1、柱子可以分为：加压，常压，减压、柱子可以分为：加压，常压，减压v压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。v减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的减压柱能够减少硅胶
3、的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。间长）。v以前曾经用过减压柱但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。以前曾经用过减压柱但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。v加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加
4、压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。特别是在容易分解的样品的分离中适用。v压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。本人觉得加压柱在普通压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。本人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。的有机化合物的分离中是比较适用的。2、关于柱子的尺寸、关于柱子的尺寸v应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原
5、点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。的难度。v试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。就比较容易得到完全分离了。v当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算
6、什么了。产品来说也许就不算什么了。v现在见到的柱子径高比一般在现在见到的柱子径高比一般在1：510。书中写硅胶量是样品量的。书中写硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择要具体分析。倍，具体的选择要具体分析。v如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在在0.20.4，杂质相，杂质相差差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用毫克的样品，用2cm20cm的柱子）；如果相差不到的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用加柱子的
7、直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。的，也可以减小淋洗剂的极性等等。3、关于湿法、干法上样、关于湿法、干法上样 v湿法上样省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯湿法上样省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。v很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，
8、而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。v有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。v干法上样：样品和硅胶的量有一种说法是干
9、法上样：样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。附在硅胶上）。v干法上样溶剂的选择，（最便宜，最安全，最环保）。所以大多选用石干法上样溶剂的选择，（最便宜，最安全，最环保）。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。油醚，乙酸乙酯。v文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要，因为其极性很小，有文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要，因为其极性很小，有时还是非它不可。时还是非它不可。v乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别
10、让溶剂流干了，那乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。样柱子也就不爽了。v二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。v甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶、过应该经过后继处理，比如说重结晶、过SephadexLH-20柱等。柱等。v其他的
11、溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。v由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的，如由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的，如10升或升或25升塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常升塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯
12、的方法。v另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸在过完柱子后，
13、溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象。象。4、关于操作问题。、关于操作问题。4.1 装柱。装柱。v柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。用四氟节门的。v干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。v装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品
14、就会从一侧斜着下来）。（不然样品就会从一侧斜着下来）。v在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。v但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！至作废！4.2 加样加样v用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开；用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开；v待溶剂层下降至柱床表面时，再加少量的低极性溶剂，然后待溶剂层下降至柱床
15、表面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次；再打开活塞，如此两三次；v加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。4.3 淋洗剂的选择。淋洗剂的选择。v使所需点在使所需点在rf0.20.3左右的比较好。左右的比较好。v不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果种极性，如果rf在在0.6，即使相差，即使相差0
16、.2也不容易在柱也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。）的三次方或四次方大。4.4 样品的收集。样品的收集。v另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。可能一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。4.5 后处理后处理v 柱分后的产品，由于使用了大量的溶
17、剂，其中的杂质也会累积到产品中，柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。v另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的
18、时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。剂。v还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚乙酯和石油醚(6090),而乙醚却要选择而乙醚却要选择3060的石油醚。的石油醚。v不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气！过柱子需要耐心，不要着急。将空气排干，这样就可避免柱中有空气！过柱子需要耐心，不要着急。三、组分及化
19、合物的编号三、组分及化合物的编号Leaves fromLindera aggregataExtract.(500g)PE Extr.EtOAc Extr.BuOH Extr.Extract with PE,EtoAC,and BuOHFr.PE-A,B,CFr.EA-A,B,CFr.BT-A,B,CLAZ-PE-1,2,3LAZ-EA-1,2,3LAZ-BT-1,2,3四、化合物结构鉴定四、化合物结构鉴定v结构测定的顺序结构测定的顺序v参考文献参考文献TLC检测检测1H-NMR参考文献参考文献13C-NMR1H-1H COSYHSQC，HMBCMSNOESYX-rayCACOSY1H-NMRH
20、MBCHSQC13C-NMRDEPTNOESYSampleMS天然药物结构测定中常用的手段天然药物结构测定中常用的手段UV IR 1D-NMR MS CD ORD 2D-NMR X-ray 平面结构立体结构天然药物结构测定中常用的顺序天然药物结构测定中常用的顺序5-10mg氘代试剂氘代试剂1H-NMRMS13C-NMRESI-MSEI-MS2D-NMR1H-1H COSYHSQCHMBCDEPT查新查新IR UVHR-EIMSNOESYX-ray信号的灵敏度增高信号的灵敏度增高信号与信号间的分离度改善信号与信号间的分离度改善信号的图形趋于简单化信号的图形趋于简单化 不同分辨率的不同分辨率的1H
21、-NMR的区别的区别 不同溶剂的信号峰，及峰形不同不同溶剂的信号峰，及峰形不同 不同溶剂中的水峰位置不同不同溶剂中的水峰位置不同 同一质子的信号在不同溶剂中的位置不同同一质子的信号在不同溶剂中的位置不同 氘代溶剂的裂分取决于氘代氢核的数目，即氘代溶剂的裂分取决于氘代氢核的数目，即2n 1 经验规律经验规律:萜类萜类,甾体甾体(CDCl3,C5D5N);黄酮（黄酮（DMSO-d6)香豆素，苯丙素等香豆素，苯丙素等(CD3OD,CD3COCD3)溶剂位移溶剂位移 也叫质子去偶谱，测定该谱时去偶器的频率覆盖了全部质子也叫质子去偶谱，测定该谱时去偶器的频率覆盖了全部质子 的共振频率，故使所有的共振频率
22、，故使所有1H对对13C核的偶合影响全部消除，每个不核的偶合影响全部消除，每个不等价的碳核在图谱上均表现为一个单峰。另外，由于照射同碳上等价的碳核在图谱上均表现为一个单峰。另外，由于照射同碳上的质子所产生的增益效应，导致的质子所产生的增益效应，导致13C核的信号强度增强，提高信核的信号强度增强，提高信噪比。噪比。伯，仲，叔碳的信号强度不同伯，仲，叔碳的信号强度不同(与各个碳的纵向驰豫时间有关与各个碳的纵向驰豫时间有关)噪音去偶谱噪音去偶谱DEPT谱谱1 H-H相关谱相关谱 对角峰与相关峰对角峰与相关峰 偕偶，邻偶，烯丙偶合，偕偶，邻偶，烯丙偶合，W型偶合型偶合二二 维维 FT-NMR2.C-H相关谱相关谱(HMQC)相关峰相关峰HMBC Spectrum of Compound 7(CDCl3,500MHz)OHOHOOHHOHH-1H-93.C-H远程相关谱远程相关谱(HMBC)相关峰相关峰4.H-H远程相关谱远程相关谱(NOESY)相关峰与对角峰相关峰与对角峰3 -hydroxy-8-oxo-eremophila-6,9-dien-12-oic acid实例实例H2O峰峰氘代丙酮试剂峰氘代丙酮试剂峰杂质杂质1H-NMR spectrum of Compound 1(500MHz,Acetone-d6)OCH3对称信号对称信号亚甲基信号亚甲基信号
