1、1大家好大家好2硕士论文答辩 牛结核病胶乳凝集方法的研究以及 临床的初步应用3汇报内容一、文献背景及研究目的意义二、研究思路与策略三、试验方法、结果与讨论四、小结与展望五、研究成果4一、文献背景及研究目的意义 文献背景n 结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。据WHO估计全球约有20亿人感染，每年新病例达800-1000 万，约300万人死亡。n牛结核病被国际兽医局（OIE）定为B类动物传染病。历来是严重威胁奶业健康发展的重大传染病。n除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会取得成功。5 The whole genetic sequence of Mycobacterium tub
2、erculosis6一、文献背景及研究目的意义文献背景n我国对奶牛结核执行检疫-捕杀政策；n灵敏快速特异的检测方法是有效执行该防疫政策的重要前提；n牛结核病的防制主要是采用牛提纯结核菌素进行变态反应检疫；n皮内变态反应的缺点:结核菌素成分复杂其特异性受其他分枝杆菌影响而造成假阳性；n反复检疫、结核病感染严重、体质低下、牛体内抗体水平较高等都可造成假阴性；7文献背景及研究目的意义研究目的意义n本论文旨在建立奶牛结核病抗体检测的有效方法 牛结核病乳胶凝集方法(LAT)；n以求将LAT、结核菌素皮内变态反应(TST)联合使用，避免TST对病程严重牛的漏检，建立更加科学、客观的根除策略。8M bovi
3、sM bovis BCG检测机体反应体液免疫细胞免疫IFN-gamma assay检测病原DNA蛋白PCR皮内变态反应感染免疫新结核疫苗细菌培养感染?免疫？二、研究思路与策略 总体策略胶乳凝集方法胶乳凝集方法ELISA9PCRmpb70pMD18-T测序双酶切pET-28aE.coli BL21转化原核表达原核表达MPB70EDC羧化乳胶颗粒羧化乳胶颗粒制备制备0.5 的乳胶试剂的乳胶试剂组装成组装成奶牛结奶牛结核病乳核病乳胶凝集胶凝集抗体检抗体检测试剂盒测试剂盒研究思路与策略技术路线10三、试验方法、结果与讨论n克隆牛型结核分枝杆菌mpb70n表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70n建立牛结核病
4、乳胶凝集抗体检测方法n临床样本检测n结果分析讨论11试验方法、结果与讨论本论文中构建的重组载体12试验方法、结果与讨论克隆牛型结核分枝杆菌mpb70用PCR方法克隆牛型结核分枝杆菌mpb70ItemsVolume(L)模板5引物(10pM)2dNTP(2.5mM)210Taq buffer(含Mg2+)5双蒸水36Taq polymerase0.5总共5013试验方法、结果与讨论表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70把把PCR方法克隆的方法克隆的mpb70片段连接到片段连接到pMD18-T，构建重组质粒，转化，构建重组质粒，转化DH5；小提质粒酶切回收；小提质粒酶切回收mpb70片段并连接到片段并
5、连接到pET-28a，构建重组质粒，构建重组质粒，然后转化到然后转化到BL21中，诱导表达中，诱导表达MPB7014试验方法、结果与讨论胶乳颗粒偶联蛋白模式图 羧化乳胶微球颗粒Carboxyl(COOH)microparticles羧基基团通过水溶性碳化二亚胺（EDC）活化后，再与蛋白质上的氨基基团结合。15建立乳胶凝集抗体检测方法最佳偶联MPB70蛋白量的确定 在4mL浓度为0.25的羧化胶乳中，分别加入不同量的MPB70，从10g、20g、30g、50g递增至150g，在硼酸缓冲液中室温作用6h后收集上清，经UV120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，The best quantity o
6、f linked MPB70 protein 16建立乳胶凝集抗体检测方法最佳偶联时间的选择 在1mL浓度为1的羧化胶乳中，加入150g MPB70，改变致敏时间，于0.5、1、2、4、6、8、10和12h进行致敏,致敏后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量。17建立乳胶凝集抗体检测方法最佳胶乳浓度的确定最佳胶乳浓度的确定 确定上述条件的基础上，在确定上述条件的基础上，在4mL浓度为浓度为0.25的羧化胶乳中，加入的羧化胶乳中，加入150g MPB70蛋白，改变胶乳最终致敏浓度，使胶乳微球的终浓蛋白，改变胶乳最终致敏浓度，使胶乳微球的终浓度分别为度分别为2，1，0.5，0.
7、25和和0.125，在室温作用，在室温作用6h后后收集上清，经收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量分光光度计测定上清中剩余的蛋白量 18试验方法、结果与讨论乳胶凝集方法条件优化的结果n确立乳胶致敏MPB70的一系列最佳反应条件：乳胶最终浓度0.5%；EDC与乳胶最佳反应时间为3h；MPB70的最佳致敏量为0.1mg/ml乳胶；MPB70最佳反应时间为6h；以及一系列的缓冲液的离子浓度和pH值等。19建立乳胶凝集抗体检测方法偶联反应终止剂n抗原与乳胶微球过度偶联会导致抗原失活，从而降低抗原-微球基质与抗体结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。常用的终
8、止剂为乙醇胺和甘氨酸。经试验验证乙醇胺的终止效果要好于甘氨酸，故选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度0.1M，剂量为1mL浓度为1的羧化乳胶中加入50L，终止时间为15min。20建立乳胶凝集抗体检测方法封闭剂的选择n乳胶微球上未结合抗原的位点需要用封闭剂封闭以防止出现非特异性反应，但同时过度的封闭会降低乳胶试剂的敏感性。所以需要优化合适的封闭条件。在实验中，发现用BSA封闭后乳胶试剂的敏感性会有所降低，而当不用封闭剂封闭时，并没有出现非特异性反应，所以，制备乳胶试剂时不进行封闭。21建立乳胶凝集抗体检测方法LAT的特异性和敏感性试验 22批内重复实验结果23批间重复实验结果24建立乳胶凝集抗体检
9、测方法重复性试验 n同样方法处理乳胶5批，每批5个重复；n批内：从5批中抽3批，每批中抽取3个，做批内比较；n批间：从5批中抽3批，每批中抽取3个，做批间比较；n结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本胶乳凝集方法的批内和批间重复性良好。25建立乳胶凝集抗体检测方法临床样本检测n对武汉市奶牛场A临床检测的70头奶牛中，TST、MPB70-LAT、IHA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、32、34、42；n对武汉市奶牛场B临床检测的61头奶牛中，TST、MPB70-LAT、Milk-ELISA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、47、52、42；n几种检测方法的检
10、出率和符合率见下表：26建立乳胶凝集抗体检测方法武汉市牛场70份临床样本检测结果27建立乳胶凝集抗体检测方法武汉市B牛场61份临床样本检测结果28四、小结与展望nMPB70是一种牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质，其分泌量占牛分枝杆菌培养基蛋白总量10%；nMPB70在大肠杆菌中可以高效率的表达，且具有天然的热稳定性，为诊断方法的建立及诊断试剂的保存提供了有力条件；n以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联，双功能试剂，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。29五、小结与展望n通过临床检测结果，与国际金标准TST的比较，说明MPB70蛋白乳胶凝集方法符合特异快速
11、敏感检测方法的标准。与皮内变态反应联合应用可以为我国的牛结核病检疫防控提供有效的工具。n基于以上临床试验和分析讨论，可见本方法的优点，有望开发成诊断试剂盒，在临床上广泛推广应用。本实验室已经递交了新兽药证书申请材料，临床试验已获审批，且正在进行。30研究成果在读期间发表文章n钦博，胡巧云，喻正军，晁彦杰，张桂荣等.牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用，中国预防兽医学报n胡巧云，钦博，张桂荣等.结核分枝杆菌CFP10蛋白基因的原核表达及在免疫诊断上的初步运用，全国结核病分子生物学与免疫学研究及应用研讨会，湖南，张家界，2005.09n张桂荣，陈颖钰，钦博等.牛结核菌素ELISA方法
12、用于诊断奶牛结核病的研究，中国畜牧兽医学会家畜传染病分会第十一次学术会议，四川，雅安，2005.09nZhengjun yu,Meiling Jin,Xiaojuan Xu,Ruihua Zhang,Hongbo Zhou,Qiaoyun Hu,Haiya Wu,Bo Qin,Yadi Tan,Huanchun Chen.Development of a specific Latex Agglutination Test based on recombinant HA proteins for detecting antibodies to H5 avian influenza viruses
13、,Avian Disease.31n本论文是在指导老师谭亚娣副教授，郭爱珍教授和导师陈焕春院士的悉心指导下完成的。他们渊博的学术理论、宽广的待人胸怀、严谨治学的科学态度、孜孜不倦的工作热情是我一生学习的榜样。在此，向谭亚娣副教授，郭爱珍教授和陈焕春院士致以最崇高的敬意和诚挚的谢意。n在实验期间，我得到了金梅林、吴斌、方六荣、周锐、曹胜波、吴美洲、等老师在学习和实验技术上的关心和帮助，在此深表谢意。n特别感谢喻正军同学，同时也感谢陈剑峰、张安定、但汉并、马燕、郭洪、郭红燕等同学在实验和生活中给予我的支持和帮助。n感谢张桂容、李川、胡巧云、吴波、张书环、曹莎、晁彦杰、陈颖玉、陈鑫、朱堂明等给予的大量帮助。n最后还要感谢我的家人，是他们的无微不至的关怀和无私的爱心给予了我今天的一切。致致 谢谢32Thank you!
