1、 基因工程课程设计题目：基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用姓名： 学号： 年级： 专业：生物技术专业指导教师： 一 选题依据课程设计目的l 了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势； l 学习理解基因工程育种技术及其操作原理；l 研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。 基因工程作为21世纪的一种新型生物技术，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细
2、胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。二 文献综述内容1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并
3、赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。-干扰素具有较强的免疫调节、细胞抑制功能和抗病毒活性功能,在临床上有一定的应用价值。由于天然-干扰素来源有限,产量甚微,因此有关-干扰素的基因工程技术研究1,2十分活跃,并带动了重组人干扰素-(rIFN-)下游技术的研究3。优化发酵工艺以获得稳定的高质量发酵产物,可以降低下游技术中分离纯化的成本和难度。但是,不能得到稳定的高效表达产物是基因工程中普遍存在的问题4,除表达系统本身因素外,还
4、涉及诸多其它因素。通过对pBV220IFN-DH5工程菌高效表达rIFN-因素的研究,并选择合适条件分离包含体,获得了rIFN-含量和活性都很高的粗提液。采用高效疏水色谱法(HPHIC)对rIFN-进行一步同时纯化与复性,方法不仅简单、快速,而且避免了采用大量溶剂稀释复性和通过透析除去变性剂的麻烦。1. 基因工程育种基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与
5、前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主 要环节。2. 运用基因工程进行定向育种的新技术l 定点突变(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变
6、。近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR简称EOPCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR，简称OOEPCR)、单管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。l
7、 TAMS定点诱变技术 2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100。l 定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，显著提高了该酶的稳定性。3.易错PCRDNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能
8、方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error_prone PCR，简称EPPCR)。此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1。另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20。孔荣等利用易错PCR使D-海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了
9、1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。3. DAN重排DNA重排(DNA shufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)。此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循
10、环中，那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI对靶序列进行消化，发明了递减法建立杂交酶技术（ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术的用途。Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNase I产生重排片
11、段。Bergquist等开发的DOGS技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。4.基因组重排基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定
12、向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该
13、方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24 000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21，而后者(SF21)是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约1 000 000个菌株后才获得的。由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所的徐波等以产量性状为标记特征，应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3。2、基因工程育种技术在大肠杆菌种的应用大肠杆菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色体DNA已测序完
14、毕，全基因共含有4 405个开放阅读框，其中大部分基因的生物功能已被鉴定。作为一种成熟的基因克隆表达受体，大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因的分离扩增、DNA序列分析、基因的表达产物功能鉴定等。由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，大肠杆菌的分子遗传学背景已相当明了，不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于异源蛋白生产的分子工厂。因此，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌，以规模化生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。现在已有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M
15、-CSF及Hb等。工业中常用于生产医药蛋白如人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素和抗体。以下以生产人干扰素为例介绍其应用。人干扰素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165个氨基酸组成的多肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、修复DNA结构损伤等作用。hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等均具有治疗作用。大肠杆菌表达系统具有生长快速、发酵成本低、表达水平高等优点,是生产外源蛋白的理想表达体系。在大肠杆菌温度诱导表达外源蛋白的发酵过程中,如何控制升温诱导后菌体的生长,提高产物的比生产速率,是实现高密度高表达的关键。本文采用大肠
16、杆菌BL21(pBAI)表达hIFNa2b,其表达通过温控型PL启动子调控。考察了补料方式对hIFNa2b生产速率的影响,hIFNa2b表达水平达到6 540 mg/L。参考文献：1 张惠展.基因工程.上海: 华东理工大学出版社,2005,82 朱筠,李志敏,张倩,甘人宝,叶勤.重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b.华东理工大学学报,2008,3(2):184-1883 聂明,李怀波,万佳蓉,周传云.工业微生物遗传育种的研究进展.现代食品科技，2005,21(3):184-1874 王参军,邹文艺,张玲,范清林,宋礼华. 突变人干扰素-2b基因5端提高其在大肠杆菌中的表达.安徽医
17、科大学学报,2010,45(2):149-1535 代云见,王明蓉,杜天飞.微生物基因工程育种技术的研究进展.药研动态(国外医药抗生素分册),2008,29(5):193-2006 王海波,申烨华,秦芳玲等.大肠杆菌生产重组人干扰素-培养基的研究.西北大学学报(自然科学版),2003,33(2):174-1787 邹钟诚,侯剑英,王增学,苏冬梅.大肠杆菌发酵重组人干扰素-2a的高密度、高表达.微生物学杂志,1999,19(1):24-268 周鸣南,方深高,陶征宇,何丽敏.人a2b型干扰素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达提高.中国医药工业杂志,1995,26(4):152-1559 党建章,郑
18、雄敏,李飞.PVA包埋产延胡索酸酶的黄色短杆菌的固定化研究.南昌大学学报,1995,19(4):380-384三、研究方案材料菌株 宿主菌E. coli BL21(DE3)BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) gal(DE3),重组质粒为pBAI,带有氨苄青霉素耐药性标记,hIFNa2b基因表达受PL启动子和质粒cI857编码的蛋白调控。培养基 种子培养基为LB培养基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠。分批发酵培养基为含葡萄糖5 g/L的LB培养基。未特别注明的补料分批发酵培养基均为含葡萄糖5 g/L的2L
19、B培养基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),补料液为400 g/L的葡萄糖。培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯,采用去离子水配制。2.1.2 培养方法 种子培养 从-20C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入装有30 ml种子培养基的250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30C下培养10 h,为一级种子;将一级种子以1.5%的接种量转接至装有70 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中,相同条件培养9 h,为二级种子。 发酵罐培养 将二级种子以6%的接种量接入5 L发酵罐(RIBE-5型)中。培养液装量为2.5 L，
20、生长阶段控制温度30C,表达阶段控制温度42C，发酵过程中控制pH为7.0,通气量4 L/min，初始搅拌转速为400 r/min,发酵过程中转速逐渐提高以维持溶氧大于20%。补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率流加。恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(Lh)的速率流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为0.27 g/(gh)，每小时根据菌体浓度调整葡萄糖的流加速率。2.1.3 测定方法菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600 nm处的光密度(OD600),根据标准曲线计算菌体干重。葡萄糖测定采用葡萄糖
21、测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定。乙酸测定采用气相色谱法5。hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白6,凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统(Smart View analysis program,上海复日科技有限公司)定量。取发酵液于12 000 r/min,4C下离心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4C)洗涤,然后溶于上样缓冲液中12mmol/L、pH 6.8 Tris-HCl,甘油(=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇(=0.02),溴酚兰(0.5
22、g/L。3 结 论目前hIFN2b在临床的应用广泛,需求量大,但由于生产水平的限制,价格仍旧较高。本文通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。分批培养时乙酸积累,对hIFNa2b表达有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表达期无乙酸积累,提高了hIFNa2b的表达水平。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。恒比供应速率流加葡萄糖并在诱导前添加酵母抽提物,虽然总表达量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生产速率高达1 006 mg/(Lh),是分批培养时的3.08倍,是恒速流加方式时的1.84倍,并且对有机氮源的得率提高到138 mg/g,大大缩短了发酵时间,为该表达系统的实际应用创造了条件。
