1、第六章基因工程的基本技术优选第六章基因工程的基本技术优选第六章基因工程的基本技术核酸提取技术核酸提取技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术PCRPCR技术技术核酸杂交技术核酸杂交技术DNADNA测序技术测序技术主要内容主要内容第一节、第二节第一节、第二节前章节已介绍前章节已介绍第三节第三节 PCR PCR 技术技术第三节第三节 PCRPCR技术技术PCR PCR 基本原理基本原理基本过程与反应体系基本过程与反应体系PCRPCR引物设计的原则引物设计的原则PCRPCR产物质量的影响因素产物质量的影响因素PCRPCR的种类的种类 中文名称：聚合酶链式反应中文名称：聚合酶链式反应 1、PCR原理：原理：变性温
2、度下，变性温度下，DNADNA双链变性双螺旋解开成双链变性双螺旋解开成单链单链DNADNA，在退火温度中人工合成的特异引，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链物根据碱基互补配对原则与单链DNADNA特异结特异结合，然后在合，然后在DNADNA聚合酶的作用下，在延伸温聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板在引物的引导下合成与模板DNADNA互补的新链，互补的新链，实现实现DNADNA的扩增。的扩增。技术技术3：PCR技术技术(polymerase chain reaction)PCRPC
3、R操作流程操作流程949450 50 72 72 2、PCR反应过程：反应过程：变性：变性：DNADNA双链变为单链；双链变为单链；退火：引物与模板结合；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；延伸：合成互补链；上述过程通过上述过程通过PCRPCR仪的仪的程序设计及自动运作完程序设计及自动运作完成。成。3、PCR反应体系：反应体系：体系成分：体系成分：模板模板DNADNA、引物、引物、TaqTaq酶酶(热稳定热稳定性性)、dNTPdNTP、反应缓冲液、反应缓冲液（Mg2+、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）。应用：该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。DNA/DNA的杂交作用 检
4、测特定生物有机体之间的亲源关系；dideoxy-mediated chain-termination methodddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPThreshold lineLabeling ddNTP withEach dRhodamine give different color从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列一般成对出现，长度为15-30个核苷酸；核酸杂交常用几种膜的性能比较PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 6-15此方法有很高的敏感性和特异
5、性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。a defined DNA restriction fragmentDNA印迹（Southern blotting）在进行核酸印迹转移的时：Real Time Sequencing by Synthesis1 1）、引物（寡聚核苷酸）、引物（寡聚核苷酸）一般成对出现，长度为一般成对出现，长度为15-3015-30个核苷酸；个核苷酸；使用浓度：使用浓度：0.1-0.5uM0.1-0.5uM，高达，高达1uM1uM；引物设计原则：引物设计原则：G+C含量45-55%；Tm值高于55；引物特异性；引物扩增跨度；是否形成引物二聚体 引物的3端严防
6、错配。2 2）、模板）、模板DNADNA：基因组基因组DNADNA、质粒、质粒DNADNA、其它、其它DNADNA片段；片段；质量要求：不高质量要求：不高3 3）、）、TaqTaq酶酶(热稳定性热稳定性)：常规酶常规酶高保真酶：高保真酶：ExTaqExTaqLa TaqLa Taq酶酶4 4）、反应缓冲液成分：）、反应缓冲液成分：BSABSA、Tween20Tween20、DTTDTT、明胶、明胶-保护酶作用保护酶作用 Tris.clTris.cl提供缓冲作用提供缓冲作用 4 4、影响影响PCR PCR 产量、产量、质量的因素：质量的因素：(1)(1)TaqTaq酶：常用酶：常用1-2.5U/
7、1-2.5U/反应（反应（25uL25uL）浓度低，扩增产物不够；浓度低，扩增产物不够；浓度高，非特异性扩增增加；浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；酶的活性；(2)(2)dNTPdNTP的浓度：的浓度：常用常用100-200100-200mol/L，不能低于，不能低于2020mol/L，特异性、保真性；特异性、保真性；(3)(3)模板：主要考虑模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng；(4)(4)引物浓度：引物浓度：0.1-0.5mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体引物二聚体；(5)(5)MgMg2+2+浓度：浓
8、度：常用 0.5-2.5mmol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性。(6)(6)PCRPCR反应程序设定反应程序设定1 1）变性温度和时间）变性温度和时间：要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5（2小时）95（40min）97（5min）94变性比较彻底，酶的半衰期也不短。2 2）引物退火温度）引物退火温度TmTm与时间；与时间；Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2，G、C计为4，时间一般为40秒到60秒3 3）引物延伸温度与时间）引物延伸温度与时间：72最佳，30-100nt/s，也有用68 如La Taq4 4）循环数：）循环数：25-35 cycles 之间，过多则非特
9、异扩增增加；平台效应。以普通以普通PCRPCR 50 50 l reaction solution l reaction solution 为例为例)1010 PCR bufferPCR buffer25mM MgCl25mM MgCl2 2dNTP Mixture(10mM each)dNTP Mixture(10mM each)primer 1 primer 1（10 10 M)M)primer 2 (10 primer 2 (10 M)M)Taq polymerase(5U/Taq polymerase(5U/l)l)DNA template(0.1 DNA template(0.1 g
10、/g/l)l)ddHddH2 2O O totaltotal5 5 l(1l(1)4 4 l(l(2mM2mM)1 1 l(0.1l(0.1mMmM)1 1 l(l(0.2 0.2 MM)1 1 l(l(0.2 0.2 MM)0.6 0.6 l(2U/50 l(2U/50 l)l)1 1 l l36.5 36.5 l l50 50 l l5 5、PCRPCR例子（例子（Example of reaction solutionExample of reaction solution）反应体系配置：反应体系配置：DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。分离产物有两种
11、基本方法：单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。核酸杂交常用几种膜的性能比较Amplification:emulsion PCR浓度低，扩增产物不够；可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。2005 Sep 15;437(7057):326-7用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子以普通PCR 50l reaction solution 为例)不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消
12、除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。dATP,dCTP,dGTP,dTTP影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性。Threshold line相关内容见分子生物学Real Time Sequencing by Synthesiswestern blotting（Pr）Real Time Sequencing by Synthesis一次测序反应一般可读出600800bp，若待测序的DNA片断较大，则需从多处不同的位置引导测序反应。PCR thermal program94 C94 CTm72 C72 C4 C1min30sec30sec1min5 Cendless30 cycle
13、s 循环数循环数Heat denaturationHeat denaturePrimers annealingExtensionLast extensionEnding reactionTa:annealing temperature设计的反应程序设计的反应程序相应作用相应作用6 6、PCRPCR的种类的种类RT-PCRRT-PCR特异特异PCRPCR锚定锚定PCRPCR反向反向PCRPCR套式套式PCRPCR不对称不对称PCRPCR长程长程PCRPCR锅柄锅柄PCRPCR免疫免疫PCRPCRRAPDRAPD定量定量PCRPCR原位原位PCRPCR F F R R（1 1）特异特异PCRPCR
14、 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。的。（2 2）RT-PCRRT-PCR：是一类以是一类以mRNAmRNA为最初模板的基因的扩增。为最初模板的基因的扩增。A A A A A A A A A AA A A A A A A A A A5CAP5CAPT T T T T T T T T T TT T T T T T T T T T T（3 3）反向反向PCRPCR：根据已知序列扩增两侧序列的方法。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列酶切酶切酶切酶切引物引物2 2引物引物1 1此此PCRPCR操作过程：操作过程：酶切基因组酶切基因组D
15、NADNA连接环化目的连接环化目的DNADNA用引物用引物1 1和引物和引物2 2组合扩增出侧翼序列组合扩增出侧翼序列（4 4）定量定量PCRPCR广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义的定量PCR技术是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。用途：用途：分析基因组中某个基因的拷贝数或分析基因的转录表达丰度。指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知
16、模板进行定量分析的方法。实时荧光定实时荧光定量量PCRPCR技术技术 原理：通过实时检测原理：通过实时检测PCRPCR每一个循环扩增产物相对每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量初始模板量X0X0的对数值与的对数值与C(T)C(T)值之间呈线性关系：值之间呈线性关系：log X0=-log(1+Ex)*Ct+log N Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04阈值线阈值线CtCt值值CtCt值值Ct Ct 值的定义值的定义 在荧光定量在荧光定量PCRPCR技术中，有一个很重要
17、的概念技术中，有一个很重要的概念 CtCt值。值。C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthresholdCtCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示）数（如后图所示）Heat denatureStrategy for sequencing a DNA fragment1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。检测重组体克隆
18、的菌落杂交技术Real Time Sequencing by Synthesis基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段；Random clones4）一条DNA片段一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；A A A A A A A A A A基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统意义：用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。5 32P GTCATGTGCTSouthern 凝胶转移杂交技术过程5 32P GTCATGTG原理：用于扩增已知一端序
19、列的目的DNA。不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 6-155、蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术2、RNA印迹技术（Northern blotting）PCR PCR反应的前反应的前1515个循环的荧光信号作为荧光本底信个循环的荧光信号作
20、为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是号，荧光域值的缺省设置是3-153-15个循环的荧光信号的个循环的荧光信号的标准偏差的标准偏差的1010倍，即：倍，即：threshold=10 threshold=10 SDcycle 6-15 SDcycle 6-15 荧光域值（荧光域值（thresholdthreshold）的设定）的设定 研究表明，每个模板的研究表明，每个模板的CtCt值与该模板的起始拷值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其
21、中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代坐标代CtCt值。因此，只要获得未知样品的值。因此，只要获得未知样品的CtCt值，值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04阈值线阈值线CtCt值值CtCt值值荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？相关内容见相关内容见分子生物学分子生物学原理：原理：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC
22、和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定锚定PCRPCR主要用主要用于分析于分析具有可具有可变末端变末端的的DNADNA序列序列原理：原理：用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为505010011001.在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称不对称PCRPCR不对称不对称PCRPCR主要为测序制备主要为测序制备ss-DNAss-DNA，尤为用，尤为用cDNAcDNA经不对称经不对称
23、PCRPCR进行进行DNADNA序列分析是研究真核序列分析是研究真核DNADNA外显子的好方法。外显子的好方法。第四节第四节 核酸杂交核酸杂交（印迹）技术（印迹）技术本节内容本节内容印迹基本原理与过程印迹基本原理与过程DNADNA印迹（印迹（Southern blottingSouthern blotting）RNARNA印迹（印迹（Northern blottingNorthern blotting）斑点杂交斑点杂交原位杂交原位杂交蛋白质蛋白质/DNA/DNA、蛋白质、蛋白质/RNA/RNA杂交技术杂交技术western blottingwestern blotting （PrPr）核酸分子
24、杂交（核酸分子杂交（DNA/DNA DNA/DNA or DNA/RNAor DNA/RNA）技术）技术 杂交分子：彼此退火的核酸来自不同的杂交分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子；生物有机体，而形成的双链分子；作用：作用：DNA/DNA DNA/DNA的杂交作用的杂交作用 检测特定生物检测特定生物有机体之间的亲源关系；有机体之间的亲源关系；DND/DNADND/DNA或或RNA/DNARNA/DNA的能力，揭示的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。核酸片断中某种特定基因的位置。核酸杂交常用几种膜的核酸杂交常用几种膜的性能比较性能比较 1.1.核酸印迹转移：将核酸样品
25、转移到固体核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用支持膜上。利用的是毛细管作用 2.2.印迹杂交：印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的有标记的DNA/RNADNA/RNA进行杂交。进行杂交。尼龙膜或硝酸纤维素尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤膜杂交的步骤根据毛细管作用的原理，根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的使在电泳凝胶中分离的DNADNA片片段转移并结合在适当的滤膜上，段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链然后通过同标记的单链DNADNA或或 RNARNA探针的杂交作用检测这些探针的杂交作用检测这些被转移的被转移的DNADNA
26、片段，这种实验片段，这种实验方法叫做方法叫做DNADNA印迹杂交技术。印迹杂交技术。由于它是由由于它是由E.SouthernE.Southern于于19751975年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫Southern DNA Southern DNA 印迹转移技术。印迹转移技术。1 1、DNADNA印迹杂交印迹杂交（a a）（b b）（c c）（d d）（e e）基因组基因组DNADNADNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNADNA片段片段X X光底片光底片在进行核酸印迹转移的在进行核酸印迹转移的时：时：要将以转好的硝酸
27、纤维要将以转好的硝酸纤维素膜在素膜在8080度下烘烤度下烘烤1 12 2小时；小时；紫外线交联法，将紫外线交联法，将DNADNA分子上的部分胸腺嘧啶残基分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。氨基基团之间进行交联。利用利用SouthernSouthern印迹法可进行克隆印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析分析及限制性片断长度多态性分析（RFLPRFLP）等。）等。19791979年，等人发展而来，是将年，
28、等人发展而来，是将RNARNA分子从电分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与于这种方法与DNADNA印迹杂交技术十分类似，又称印迹杂交技术十分类似，又称为为Northern blottingNorthern blotting。2 2、RNARNA印迹技术印迹技术（Northern blottingNorthern blotting）应用：应用：NorthernNorthern杂交技术应用于特定性状基因在杂交技术应用于特定性状基因在mRNAmRNA
29、水平上水平上的动态表达研究。应用于定位克隆中寻找新基因，寻找染色体的动态表达研究。应用于定位克隆中寻找新基因，寻找染色体特定区域的表达序列是大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克特定区域的表达序列是大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克隆的主要限速步骤，隆的主要限速步骤，NorthernNorthern杂交作为寻找这些序列的有效方杂交作为寻找这些序列的有效方法，有助于这些疾病候选基因的筛选；法，有助于这些疾病候选基因的筛选；斑点印迹杂交是在斑点印迹杂交是在SouthernSouthern印迹印迹杂交的基础上发展的一种的杂交的基础上发展的一种的快速快速检测特定核酸检测特定核酸（DNADNA和和RNARN
30、A）分）分子的核酸杂交技术。是指将待测子的核酸杂交技术。是指将待测的的DNADNA变性后点加在硝酸纤维变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜素膜（或尼龙膜,NC,NC膜）上，用膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜已标记的探针进行杂交，洗膜(除去未接合的探针除去未接合的探针)，放射自显，放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。改变的检测。3 3、斑点印迹杂交、斑点印迹杂交（dot blottingdot blotting）意义：用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋意义：用原位杂交技术，可在原位研究
31、细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。检测重组体克隆检测重组体克隆的菌落杂交技术的菌落杂交技术应用：应用：不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定在与某一特定DNADNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的发生
32、此中结合之精确的DNADNA序列的特异性。（加入超量序列的特异性。（加入超量的非标记竞争的非标记竞争DNADNA）。）。可以间接的阐明体内发生可以间接的阐明体内发生DNADNA与蛋白质之间的相互作用。与蛋白质之间的相互作用。用具有已知转录因子结合位点的竞争用具有已知转录因子结合位点的竞争DNADNA，可检测蛋白，可检测蛋白是否属于此类转录因子是否属于此类转录因子在竞争在竞争DNADNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争估突变对竞争DNADNA性能及其转录因子结合的影响。性能及其转录因子结合的影响。在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争DN
33、ADNA与探针与探针DNADNA之间的竞争作用之间的竞争作用（a a）没有加入竞争）没有加入竞争DNADNA的正常的正常的凝胶阻滞实验，探针的凝胶阻滞实验，探针DNADNA与与特异蛋白质结合，出现阻滞条特异蛋白质结合，出现阻滞条带；带；（b b）加入的超量竞争）加入的超量竞争DNADNA与探与探针针DNADNA竞争结合同一种蛋白质，竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；阻滞条带消失；（c c）竞争）竞争DNADNA与探针与探针DNADNA分分别结合不同的蛋白质，出现同别结合不同的蛋白质，出现同（a a）一样的阻滞条带。）一样的阻滞条带。凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的
34、DNADNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。法确定两者结合的准确部位。而而足迹实验可以解决这个问题足迹实验可以解决这个问题DNaseDNase足迹实验是一类用于检足迹实验是一类用于检测与特定蛋白质结合的测与特定蛋白质结合的DNADNA序列序列的部位及特性的专门的实验技术。的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定质因子同特定DNADNA片段之间的结片段之间的结合区域。合区域。足迹实验足迹实验（footprintin
35、g assayfootprinting assay）如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。Heat denature(polymerase chain reaction)5、PCR例子（Example of reaction solution）5）一个磁珠一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。4）、反应缓冲液成分：Each dRhodamine give different
36、 color3）、Taq酶(热稳定性)：在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.Roche/454:Genome Sequencer FLX100 Mb/runProcedure在进行核酸印迹转移的时：原理：用于扩增已知一端序列的目的DNA。2）引物退火温度Tm与时间；意义：用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。3AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT 5G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和
37、第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。dideoxy-mediated chain-termination method 中文名称：聚合酶链式反应Amplification:emulsion PCR原理：原理：DMSDMS能使裸露的鸟嘌呤（能使裸露的鸟嘌呤（G G）残基甲基化，而）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的六氢吡啶会对甲基化的G G残基作特异的化学切割。残基作特异的化学切割。而而与蛋白结合的与蛋白结合的DNADNA片断上的片断上的G G残基不会被残基不会被DMSDMS甲基化，甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNADN
38、A片断的片断的序列中，不存在具这些序列中，不存在具这些G G残基末端的残基末端的DNADNA片断，出现片断，出现了空白区。了空白区。硫酸二甲酯硫酸二甲酯（DMSDMS）足迹）足迹与DNA酶足迹法类似的技术，但不用DNA酶来分解未被蛋白质结合保护的DNA部分，而是用硫酸二甲酯(DMS)来使未受保护的DNA甲基化，DNA可以在甲基化位置被化学降解，DNA分子上与蛋白质紧密结合区内的碱基不能被DMS甲基化。甲基化干扰实验（甲基化干扰实验（methyltion methyltion interference assayinterference assay）根据根据DMSDMS能够使能够使G G残基甲基
39、残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的切割甲基化的G G残基这一原残基这一原理，设计出了另一种研究理，设计出了另一种研究DNADNA与蛋白质相互作用的实与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶这种技术可以检测靶DNADNA中中特异特异G G残基的优先甲基化对残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详会有什么效应，从而更加详细地揭示细地揭示DNADNA与蛋白质之间与蛋白质之间相互作用的模式。相互作用的模式。主要局限性：它只能使主要局限性：它只能使G G残基甲基化。尽管如
40、此，它仍不残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中段中DNADNA与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。应用甲基化保应用甲基化保护作用进行的护作用进行的体内足迹实验体内足迹实验原理原理:与与SouthernSouthern或或NorthernNorthern杂交方法杂交方法类似，但类似，但Western BlotWestern Blot采用的是聚丙采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的用标记的二抗。二
41、抗。过程：经过过程：经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基
42、因表达的蛋白成分。特异性目的基因表达的蛋白成分。应用：该技术也广泛应用于检测蛋白应用：该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。水平的表达。第五节第五节 DNADNA测序技术测序技术本节内容本节内容Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学分析法化学分析法SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法新发展的新发展的DNADNA杂交测序法杂交测序法 published:Proc Natl Acad Sci USA,vol 741980 Nobel Prize Chemical F Sanger W Gilbert Maxam-Gilbert DNA sequencing by
43、Maxam-Gilbert DNA sequencing by chemical degradation chemical degradation 化学降解法化学降解法1.Basic principle特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键 直接或间接特异性识别4 种碱基 生成起始于固定起点和终止于特定碱基的一组核苷酸片段 G G反应：反应：DMSDMS使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的7 7位氮原子甲基化，其位氮原子甲基化，其后断开第后断开第8 8位碳原子和第位碳原子和第9 9位氮原子间的化学键，位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。哌啶置换了被修饰鸟嘌呤
44、与核糖的结合。G+AG+A反应：反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+CT+C反应：反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。能被哌啶所置换。C C反应：反应：在在NaClNaCl存在时，只有存在时，只有C C才能与肼发生才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。2.Procedure Templates Chemical
45、reaction a defined DNA restriction fragment radioactively labeled at one end with 32P Running PAGE(7M urea)6%20%Cleavages at specific bases Autoradiography5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5
46、 32P G从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的片段的核苷酸序列核苷酸序列变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。引物的3端严防错配。5 32P GTCAT此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性。原理：通过实时检测P
47、CR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。PCR thermal programCt值与起始模板的关系72最佳，30-100nt/s，也有用68 如La Taq又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。4）、反应缓冲液成分：T T T T T T T T T T THeat denatureup to 400,000 reads/run在进行核酸印迹转移的时：不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物
48、中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。5 32P GTCATG（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.dideoxy-mediated chain-termination dideoxy-mediated chain-termination methodmethod-Biological method-Biological method
49、 DNADNA聚合酶能够用单链聚合酶能够用单链DNADNA作为模板，合成准确的作为模板，合成准确的DNADNA互补链；互补链；该酶能够用该酶能够用22，3-3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的聚合到新生寡核苷酸链的3-3-末端，从而终止其延伸反末端，从而终止其延伸反应。应。在在DNADNA测序反应中，加入模板测序反应中，加入模板DNADNA，引物（特异性引，引物（特异性引物），物），DNADNA聚合酶，聚合酶，dAdA，dTdT，dGdG，dCdC和一种和一种ddNTPddNTP。（常用（常用KlenowKlenow大片段，无大片段，无5353外切
50、酶活性）外切酶活性）DNA synthesis will be terminated when a ddNTP is integratedSangerSanger双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的基本原理基本原理3AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT 5dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACGTAGCATCGTACCATCGTACGCATCGTACGTCATCGTACGTATemplateCATCGTACGTAGCprimerA:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddC
