1、Genetic Engineering第二章第二章 基因工程的主要技术原理基因工程的主要技术原理由于提取由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯的提纯有很多方法。其中最常用的是有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。碱抽提法。一、质粒一、质粒DNA的提取的提取plasmid DNAThe genomic DNA of E.coli:a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than
2、the cell.Genomic DNA闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；DNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；DNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心复合物结合在一起，在离心的时候的时候沉淀沉淀下去。下去。变性变性
3、溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽肽聚糖聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（震荡）的作用而降解。溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽肽聚糖聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（
4、震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活的活性，防止性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供强碱，提供pH12的碱性条件，的碱性条件，使使DNA双链双链变性变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质，使蛋白质（包括（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钠溶液的冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到调到4.8。用来用来中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子有利于变性的大
5、分子（蛋白质、（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于用于沉淀沉淀DNA。乙醇乙醇DNA分子以分子以水合状态水合状态“溶于溶于”水里，水里，乙醇能夺去乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。RNase A降解降解RNA渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。TE缓冲液缓冲液DNA保存保存液。液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。蛋白变
6、性剂蛋白变性剂，进一步抽提，进一步抽提DNA溶液中的蛋白溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。也可以自己配制。Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶，RNase A溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和
7、破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。Solution II 的配制：的配制：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复复合物和染色体合物和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。Solution III的配制：的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS3M 醋酸钠（用冰醋酸调醋酸钠（用冰醋酸调pH至至4.8）上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇倍体积的异丙醇或或2倍体积的倍体积的乙醇乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液上清液过柱过柱或酚或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉
8、淀第六步：沉淀DNA最重要的是：最重要的是：菌株的遗传背景，菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。质粒自身的拷贝数。一般要使用一般要使用endA基因基因发生突变的大肠杆菌发生突变的大肠杆菌菌株。如菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。等。（1）受体菌株）受体菌株endA基因编码基因编码核酸内切酶核酸内切酶，在在Mg2+的存在的存在下可将双链下可将双链DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片断。的寡核苷酸片断。这是直接决定这是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。（3）质粒大小）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数）质粒拷贝数质粒本身的性
9、质所决定质粒本身的性质所决定。二、基因组或其他二、基因组或其他DNA的提取的提取 一般过程及原理：一般过程及原理：1.细菌基因组细菌基因组DNA的制备的制备（1）细胞裂解）细胞裂解10%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。37 oC温育。温育。不用不用NaOH!（3）沉淀）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)除去除去多多糖糖，酚，酚-氯仿氯仿-异戊醇除去异戊醇除去蛋白蛋白。一般过程及原理：一般过程及原理：动物组织剪成小块，置动物组织剪成小块，置液氮液氮中冻结后中冻结后研研磨磨成细粉末。成细粉末。组织培养的细胞用组织培养的
10、细胞用胰酶胰酶消化松散后直接消化松散后直接使用。使用。（1）组织粉碎）组织粉碎0.5%SDS和和0.1mg/ml蛋白酶蛋白酶K。50 oC温育。温育。（2）细胞裂解）细胞裂解（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（是离子型去垢剂（detergent），可），可以使细胞膜崩解。以使细胞膜崩解。（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase。用用2倍体积的无水乙醇。倍体积的无水乙醇。（4）沉淀）沉淀DNA（可以加入（可以加入1/101/10体积的体积的3M3M醋酸氨醋酸氨辅助沉淀）辅助沉淀）一般过程及原理：一般过程及原理：（1
11、）组织粉碎）组织粉碎用用液氮液氮冷冻后冷冻后研磨研磨成细粉末。成细粉末。（2）细胞裂解）细胞裂解用用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴十六烷基三甲基溴化铵化铵/2巯基乙醇）。巯基乙醇）。或或1%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。65 oC温育。温育。用用0.6倍体积的倍体积的异丙醇异丙醇（-20 oC）。）。（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀）沉淀DNA（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase A。（可以加入（可以加入1/10体积的体积的3M醋酸氨辅助沉淀）醋酸氨辅助沉淀）。1.紫外光谱法紫外光谱法DNA（或（或 RNA）在
12、）在260nm波长处波长处有特异的紫外吸收峰。有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（用微量比色杯（10 l）在紫外分光光）在紫外分光光度计直接测定。度计直接测定。原理：原理：蛋白质在蛋白质在280nm280nm处有吸收峰处有吸收峰2 2溴化乙锭（溴化乙锭（EB）能插入）能插入DNA分子中，分子中，紫外光照射下能发紫外光照射下能发 红色荧光红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计琼脂糖凝胶电泳估计原理：原理：与与已知浓度已知浓度的的DNA电泳带荧光强度电泳带荧光强度对比对比，就可以估计出，就可以估计出DNA含量。含量。一般使用琼脂糖凝胶电泳，与一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量已知分子量的的DNA标准混合
13、液标准混合液对比对比得知。得知。DNA分子量分子量Marker有许多公司的商品，使有许多公司的商品，使用非常方便。如用非常方便。如 DNA的的Hind酶切物等。酶切物等。MarkerMarker28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNA Marker28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp10
14、0bpDNA MarkerC Transcript levels of rice KNOX genes OSH1 and OSH3 revealed by RT-PCR in leaves from wild-type(WT),phenotypic YAB3 RNAi(Y1 and Y2),and WOX3 overexpression plants(W1 and W2).Shoot apex mRNA was used as a positive control(S).1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质向与其电荷性质相反的电极相反的电极移动
15、，速度移动，速度称为电泳迁移率。称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的电泳迁移率同电场的强度强度和分子本身所和分子本身所带的带的净电荷数目净电荷数目成成正比正比。3.电泳迁移率同分子与介质的电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数摩擦系数成成反比反比。一、电泳的基本原理一、电泳的基本原理4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的本身的大小和形状大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与形状相似的分子的迁移速度主要与分子量分子量相关相
16、关:分子量越大，移动越慢。分子量越大，移动越慢。摩擦系数主要与分子的摩擦系数主要与分子的大小大小、形状形状以及以及介质的粘度有关。介质的粘度有关。5.Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，线性分子次之，伸展开环状最慢。伸展开环状最慢。Fig.2.1 Electrophoresis of DNA in agarose gels.DNA bands have been visualized by soaking the gel
17、in a solution of ethidium bromide(see Fig.2.2),which complexes with DNA by intercalating between stacked base-pairs,and photographing the orange fluorescence.Fig.2.2 Ethidium bromide.1.琼脂糖琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨胨”。是一种是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，从
18、红色海藻产物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高浓度高空隙小空隙小空隙小，分辨率高：空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。大小分子几乎以同等速率通过。空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙大小决定其分辨分子大小的能力。优点是比琼脂糖凝胶的优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多分辨率高的多。其优点是比琼脂糖凝胶的其优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多分辨率高的多。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：10005000
19、0bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性蛋白在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，质中向正极移动，移动的移动的速率主要取决于其分子量速率主要取决于其分子量大小（链的长短），大小（链的长短），从而从而把不同分子量的肽链分开。把不同分子量的肽链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer电泳方向电泳方向已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量
20、估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位,等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。一克约为一克约为6 610102323道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE考马斯亮蓝：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。硝酸银：硝酸银：灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色1.染料染料溴化乙锭。溴化乙锭。Ethidium bromide（EB）EB是扁平分子，能是扁平分子，能插入插入DNA碱基之间碱基之间，但，但不与琼脂糖结合。
21、不与琼脂糖结合。EB在在300nm紫外光照射下能紫外光照射下能发红色荧光发红色荧光，即可显示即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与荧光强度与DNA含量及大小成正比。含量及大小成正比。DNA-DNA或或DNA-RNA链杂交。用放射性同链杂交。用放射性同位素（位素（32P或或125I）标记的）标记的DNA或或RNA探针。探针。Southern 杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待
22、检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品样品。用用DNA（或（或RNA）探）探针检测针检测RNA样品样品。在变性条件下将待检在变性条件下将待检的的RNA样品进行琼脂糖凝样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理相同的原理进行转膜和用探针进行杂进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录品中是否含有基因的转录产物（产物（mRNA）及其含量。）及其含量。
23、主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。蛋白质印迹蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹，又称免疫印迹(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。复杂样品中的某种蛋白的方法。Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。所分析的细胞或组织中的表达情况。We
24、stern Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体
25、起反应，经过底物显色或放起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一
26、抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Immuno Blotting多克隆抗体多克隆抗体Blotting的
27、的结果结果单抗单抗blotting结结果果对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。阳性菌落。需要目的基因的探针。需要目的基因的探针。3一、基因扩增（一、基因扩增（gene amplification)指生物体内或体外人工方式使基因指生物体内或体外人工方式使基因拷贝拷贝数大规模增加数大规模增加。有下列五种方式：。有下列五种方式：1.环境诱发扩增环境诱发扩增5.PCR扩增扩增3.基因组进化扩增基因组进化扩增4.基因工程扩增基因工程扩增1.环境诱发扩增环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环境因子的
28、诱发下，某些基因产生明显在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。的扩增。在发育的某个阶段，某些基因的大量扩在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。增。如非洲爪蟾卵子形成过程中如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基基因的扩增。因的扩增。生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的增加，结果相关的基因聚集成簇基因聚集成簇。5.PCR扩增扩增应用聚合酶链式反应（应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩）技术，在体外特异性地扩增某个基因。增某个基因。3.基因组进化扩增基因组进化扩增4.基因工程扩
29、增基因工程扩增载体载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。携带目的基因在寄主细胞中大量复制。（1）1.PCR的发明的发明（2）Mullis由此获得由此获得1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1985年年Cetus公司的科学家公司的科学家K.B.Mullis发明了发明了PCR，使这一设想变成现实。，使这一设想变成现实。1971年年Khorana提出提出体外人工复制体外人工复制DNA的设想。的设想。当时由于当时由于引物引物和和DNA聚合酶聚合酶及及DNA测序测序技技术都没有解决，设想未能实现。术都没有解决，设想未能实现。Polymerase Chain Reaction1988年年 R.K.Sa
30、iki 把把Taq DNA聚合酶聚合酶用到用到PCR反应中。使反应中。使 PCR自动循环仪自动循环仪成为可能。成为可能。1988年年 Cetus公司发明自动热循环仪。公司发明自动热循环仪。1986年年 H.A.Erilish从从嗜热嗜热 水生菌分离出水生菌分离出耐耐高温高温的的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片断（片断（37 oC)，PCR技术才进技术才进入实用阶段。入实用阶段。双链双链DNA在在受热受热后，配对碱基的氢键断裂，后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为两条链分开成为单链单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAAC
31、TTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 3 3 5 5 3 TAGAACTTGACGTACGTA95oC模板模板模板（模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 人工合成的单链人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板与所要扩增的模板DNA双链的双链的5端相同端相同。模板模板模板模板ATCTTGAAC5 3 ACGTACGTA5 3 引物引物引物引物引物（引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延聚合酶按碱基配对原则在模板上
32、延伸伸DNA链。链。TGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 模板模板模板模板ATCTTGAAC5 ACGTACGTA5 TaqTaq72oC理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA。变性变性复性复性延伸。延伸。（5）1个循环的结果个循环的结果DNA elongation（1）第一步）第一步 变性（变性（denature）94-95 oC下下5分钟，模板分钟，模板DNA双链完全双链完全变性成单链。变性成单链。（2）第二步）第二步 复性（复性（anneal）50-60 oC下下1分钟，引物优先分钟，引物优先与模板
33、复性。与模板复性。引物的浓度高，引物的浓度高，引物的链短。引物的链短。94 oC下下1分钟，新合成的分钟，新合成的DNA双链又双链又变性成单链模板。变性成单链模板。（4）第四步）第四步 变性（变性（denature）72 oC下下1-2分钟，分钟，Taq DNA聚合酶在引聚合酶在引物的物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。第二步第二步第三步第三步第四步第四步复性复性延伸延伸变性变性95oC 5min50oC 1min72oC 2min94oC 1minPCR需要的模板量极低。需要的模板量极低。（1）特异性强）特异性强 PCR使用专门合成的使用专门合成的DNA引物引物。延伸过程是在延伸过程是在高
34、温高温下进行。下进行。（2）敏感性高）敏感性高 这就避免了一般这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物聚合酶污染和非引物延伸形成的延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！RT-PCR：对模板的纯度要求低。对模板的纯度要求低。（5）可以扩增）可以扩增mRNA 先用先用逆转录酶逆转录酶将将mRNA合成合成cDNA，再以，再以cDNA为模板进行扩增。为模板进行扩增。（3）快速）快速 整个整个PCR过程约过程约4小时即可完成。小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包不需要纯化，
35、甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。埋的组织切片也可以直接用于作模板。自从自从H.A.Erilish分离出耐高温的分离出耐高温的Taq DNA聚聚合酶，代替大肠杆菌合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片片断（断（37 oC)，PCR技术才进入实用阶段。技术才进入实用阶段。（1）Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶的最大特点是聚合酶的最大特点是热稳定性热稳定性，耐高温，非常适合耐高温，非常适合PCR过程的反复高温过程的反复高温变性要求。变性要求。热稳定性热稳定性最适温度：最适温度：75-80 oC 延伸速度：延伸速度：约约35-150nt/s.
36、酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但没有性，但没有35外切酶活性。外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！因此不能修复错误的碱基配对！合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。现错配，用于克隆基因时必须测序。金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+）。）。当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl
37、也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。4金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+）。）。当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。4Tth DNA聚合酶聚合酶无无3 5DNA外切酶活性，但高温下能外切酶活性，但高温下能逆转录逆转录cDNA，又能扩增，又能扩增DNA。VENT DNA聚合酶聚合酶有有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受能耐受100
38、oC高温高温。Pfu DNA Polymerase Taq Plus DNA Polymerase有有3-5的外切酶活性，的外切酶活性，5-3外切酶活性。外切酶活性。但但PCR产物为平端！产物为平端！是目前已发现的所有耐高温是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合聚合酶中出错率最低的。酶中出错率最低的。是是Taq和和Pfu DNA聚合酶的混合物。聚合酶的混合物。Taq的的PCR产物产物3端往往带有一个端往往带有一个A。与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端序列端序列互补互补（5端相同端相同）的短）的短DNA。位置位置3 3 即即2.75 1011 bp的基因组中有一次完全的基因组中
39、有一次完全与与19个核苷酸的序列相同的机会（或个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约机会是约210-11）。）。理论计算：理论计算：419=2.75 1011。一般引物设计为长一般引物设计为长1530bp。5端根据需要可设计成某个端根据需要可设计成某个内切酶的切内切酶的切点点顺序、顺序、RNA聚合酶识别序列聚合酶识别序列、突变位突变位点或生物素标记点或生物素标记等，方便与以后操作。等，方便与以后操作。5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 3端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，5端可以不配对。端可以不配对。templateprimer尽
40、可能提高尽可能提高G+C含量含量，以提高引物与模，以提高引物与模板的结合力板的结合力;避免避免连续相同碱基连续相同碱基排列或内部排列或内部回文序列回文序列。5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3 CTGCCAGTCTAC3 GACGG5 T发卡结构发卡结构1）2）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。序列互补。5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2Upstream primer vs Downstream primerSense primer vs Antisense primerPri
41、mer1 vs Primer2Forward primer vs Reverse primerTm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（当引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%时，时，复性温度低于复性温度低于55 oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择实际复性温度选择低于低于Tm值值5oC。手工计算：手工计算：一般估计：一般估计：引物的浓度引物的浓度一般使用终浓度各一般使用终浓度各0.5 mol/L。简并引物简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的如果引物的序列
42、是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码，就必须考虑密码的简并性。的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物简并引物。设计设计多组引物多组引物，结合位点依次位于前一组引，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的物之间。增加扩增产物的特异性特异性。引物设计现在多用引物设计现在多用专业软件专业软件 1324如如Primer5.0等等Primer 5.0但不能有但不能有蛋白质变性剂蛋白质变性剂、DNA酶酶、Mg2+的的螯合剂螯合剂等影响等影响D
43、NA聚合酶的活性。聚合酶的活性。模板的量：模板的量：不能太多不能太多，100 l反应体系中反应体系中100ng足够。足够。纯度：纯度：PCR对模板对模板DNA的纯度要求不高。的纯度要求不高。dNTPs 是是 dATP、dTTP、dCTP和和dGTP的总称。的总称。一般反应体系中一般反应体系中dNTPs混合液终浓度用混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并聚合酶的活性并增加错配率。增加错配率。Taq DNA聚合酶要求有游离的聚合酶要求有游离的Mg2+。所以所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。非特异产
44、物（杂带）。一般用一般用1.5-4.5mmol/L的的MgCl2终浓度。终浓度。借助于借助于荧光信号荧光信号来检测来检测PCR产物。可以产物。可以做到做到PCR每循环一次就收集一个数据，每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，值，从而根据从而根据Ct值值确定起始确定起始DNA的拷贝数，的拷贝数，做到真正意义上的做到真正意义上的DNA定量。定量。（1）荧光实时定量）荧光实时定量PCR Realtime PCR（或（或TaqMan PCR）CtCt值：值：样品到达域值水平所经历的样品到达域值水平所经历的循环数。循环数。扩增两个扩增两个引物外侧引物外
45、侧的未知序列的未知序列把线性把线性DNA模板转变成环形分子。模板转变成环形分子。templatetemplate3 5 5 3（传统（传统PCRPCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：技术关键：使引物的外侧序列使引物的外侧序列“转变转变”成内侧序列。成内侧序列。低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后。最后产物中产物中99%是单链是单链DNA。3 5 5 3 引物少引物少用于扩增用于扩增单链单链DNA，单链，单链DNA更适于测序。更适于测序
46、。技术关键：技术关键：两个引物的浓度相差两个引物的浓度相差100倍。倍。扩增扩增RNA模板。如模板。如mRNA或或RNA病毒。病毒。Temin,H.发现反转录酶，发现反转录酶，1975诺贝尔奖诺贝尔奖技术关键：技术关键：利用利用反转录酶反转录酶，把，把RNA反转录成反转录成cDNA，再以再以cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增。扩增。RNA template3 5 下游引物下游引物cDNA first strand3 5 上游引物上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3 5 反转录酶反转录酶Taq酶酶PCRReverse transcripti
47、on(RT)下游引物下游引物上游引物上游引物Taq酶酶Fig.3.RT-PCR analysis of Gbd 1 and Gbd 2 in Pima 90 following infection by V.dahliae after 0,2,4,8,12,24,48,72 and 96 h,respectively.M:100 bp DNA ladder.his-3 of cotton as the control.从基因组中扩增；从基因组中扩增；从载体上扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；组织样本原位扩增；微量残留微量残留DNA扩增；扩增；分析模板序列；分析模板序列；在基因的某处引入核苷
48、酸突变（缺失、重复在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。、插入、替换等）。技术关键：技术关键：利用引物的利用引物的5端序列不要求与模板严格配端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。、插入、替换等）。技术关键：技术关键：利用引物的利用引物的5端序列不要求与模板严格配端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。、插入、替
49、换等）。技术关键：技术关键：利用引物的利用引物的5端序列不要求与模板严格配端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。对，设计引物时引入突变序列。利用利用6bp长度的长度的随机序列引物随机序列引物扩增细胞中的扩增细胞中的总总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。了该引物序列在基因组中的分布状况。比较不同物种之间的基因组特征和相似性。比较不同物种之间的基因组特征和相似性。类似于限制性内切酶片断长度多态性类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为）分析，因而也称为随机扩增随机扩增多态性多态性DNA（RAPD
50、）分析。）分析。RAPD(Random amplified polymorphism DNA)1970年人们就有足够的理论知识来提出目前年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：上和技术上存在两个问题：1.当时没有能把不同长度的当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离核苷酸片断分离开开的技术。的技术。2.当时的分析思路局限于当时的分析思路局限于RNA序列分析法。序列分析法。（1965年年Cornell大学的大学的S.W.Holley等首次测定了等首次测定了75bp的酵母丙氨酸的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的
