1、一、基因工程的操作步骤：一、基因工程的操作步骤：目的基因的获取；目的基因的获取；形成重组形成重组DNA分子；分子；重组重组DNA 导入受体细胞；导入受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞；目的基因表达。目的基因表达。化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不如果运气不好，在打成好，在打成小
2、片段时，小片段时，有可能把抗有可能把抗虫基因打虫基因打断断基因组文库基因组文库如何从基如何从基因文库中因文库中获取目的获取目的基因基因?大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子基因组文库基因组文库对基因组文库对基因组文库的所有细菌进的所有细菌进行逐一筛查行逐一筛查找出有抗虫蛋找出有抗虫蛋白的菌落白的菌落该菌落所携带该菌落所携带的基因片段就的基因片段就含有目的基因含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？容易吗？2 2、形成
3、重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体)基因表基因表达载体达载体的组成的组成启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子复制起点复制起点标记基因标记基因通常用通常用同一种同一种限制酶切割目的基因和载体限制酶切割目的基因和载体(质粒质粒)，形成相同，形成相同的粘性末端，再用的粘性末端，再用DNADNA连接酶将二者连接连接酶将二者连接,形成重组形成重组DNADNA分子分子（基因表达载体）。（基因表达载体）。3 3、将重组、将重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞转化转化 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动
4、植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1.1.将重组将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将重组将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将重组将重组DNADNA导入微生物细胞导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。（1 1）将重组）将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法（2 2）将重组）将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯
5、基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植重组质粒重组质粒大肠杆菌的拟核大肠杆菌的拟核目的基因目的基因氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）（标记基因）将细菌用将细菌用CaCl2处理，使处理，使细胞处于感受态，可促细胞处于感受态，可促进细胞吸收进细胞吸收DNA分子分子（3 3）如果是导入微生物（如细菌）如果是导入微生物（如细菌）感受态感受态：细胞处于容易吸收外源性细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。的状态。处于感受态的细胞称为处于感受态的细胞称为感受态细胞感受态细胞.042抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质
6、粒A的结合点的结合点四环素抗性基因四环素抗性基因目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A A，只有，只有少数导入的是重组质粒。少数导入的是重组质粒。原理：质粒上有抗生素的抗性基因原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用方法：利用选择培养基选择培养基筛选筛选思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？没有质粒没有质粒含目的基含目的基因的质粒因的质粒正常质粒正常质
7、粒没有质粒没有质粒含目的基因的质粒含目的基因的质粒正常质粒正常质粒检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上是否插入上是否插入了目的基因（关键）了目的基因（关键）检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：）常用的技术：DNA分子杂交技术分子杂交技术蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交5.目的基因的表达目的基因的表达（1）内容：）内容：分子水平：分子水平：DNA分子杂交技术分子杂交技术核心核心DNA探针探针目的基因的脱氧核苷目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段
8、酸（单链）序列片段用荧光分子用荧光分子或或放射性放射性同位素标记同位素标记看能否形看能否形成杂合的成杂合的双链区双链区检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等过程过程:A.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段(单链单链)用放射性同位素等作标记用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针C.使探针和转
9、基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂若出现杂交带交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA.目的基因与质粒的连接目的基因与质粒的连接 基因基因DNADNA文库的构建文库的构建 将总将总DNADNA经过酶解，分离不同长短的经过酶解，分离不同长短的DNADNA片段。包片段。包含的基因片段分别克隆在质
10、粒或噬菌体载体上，感染含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。因文库。DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的单链
11、。基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无探针）与目的基因杂交，有无杂交带杂交带 传统的遗传育种方法有哪些？传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种二、基因工程与疾病治疗二、基因工程与疾病治疗（）基因工程药物（）基因工程药物（2 2）基因诊断）基因诊断（3 3）基因治疗）基因治疗三、三、基因工程与环境保护基因工程与环境保护基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种1.抗虫转基因植物抗虫转基
12、因植物2.抗病转基因植物抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）4.利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质基因工程在农业上的应用：基因工程在农业上的应用：1 1）高产、稳产和具优良品质的品种）高产、稳产和具优良品质的品种2 2）抗逆性品种）抗逆性品种基因工程与疾病治疗基因工程与疾病治疗v 基因工程药品的生产基因工程胰岛素基因工程胰岛素 胰岛素是治疗糖尿病的胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰胰腺只能
13、提取腺只能提取4-5g4-5g的胰岛的胰岛素，其产量之低和价格素，其产量之低和价格之高可想而知。之高可想而知。基因工程胰岛素基因工程胰岛素 将合成的胰岛素基因导将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每入大肠杆菌，每2000L2000L培养液就能产生培养液就能产生100g100g胰胰岛素！大规模工业化生岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了，还使其价格降低了30%-50%!30%-50%!基因工程干扰素基因工程干扰素 干扰素治疗病毒感染简直是干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药万能灵药”！过去从人血中提取，过去从人血中提取，
14、300L300L血才提取血才提取1mg1mg！其其“珍贵珍贵”程度自不用多说。程度自不用多说。SCID的基因工程治疗的基因工程治疗 重症联合免疫缺陷（重症联合免疫缺陷（SCIDSCID）患者缺乏正常的）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称编码腺苷酸脱氨酶（简称ADAADA）的基因（）的基因（adaada）发）发生了突变。可以通过基因生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。工程的方法治疗。基因治疗SCID的过程基因工程与生态环境保护基因工程与生态环境保护 基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分解多能吞食和分解多种污染环境的物质。种污染环境的物质。43 结束语结束语
