1、12现代生物技术现代生物技术基因工程技术基因工程技术 细胞工程技术细胞工程技术 酶工程技术酶工程技术 发酵工程技术发酵工程技术 细胞培养细胞培养从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞从原培养容器中分离细胞 -传代培养传代培养3原代培养原代培养采血方法：采血方法：人人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠）小动物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。法、断颈取血或股动脉放血。兔兔 耳静脉或动脉穿刺取血。耳静脉或动脉穿刺取血。4血液抗凝
2、方法：血液抗凝方法：肝素法肝素法：按每：按每mlml血液约用血液约用0.1-0.2mg0.1-0.2mg肝素（即肝素（即5%5%肝素溶液肝素溶液2-42-4l l）；）；草酸盐法：草酸盐法：取草酸钾取草酸钾0.2g0.2g，草酸铵，草酸铵0.3g0.3g，加双蒸水，加双蒸水10ml10ml溶解后，取溶解后，取0.2ml0.2ml放入放入5ml5ml的试管中，使其干燥。若采用的试管中，使其干燥。若采用5ml5ml以下的血液可直接以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；注入此试管中，轻轻摇晃；枸橼酸钠法：枸橼酸钠法：先配制先配制2%2%枸橼酸钠，取枸橼酸钠，取0.15-0.2ml0.15-0.2m
3、l加于加于1ml1ml血液中即血液中即可抗凝；可抗凝；EDTAEDTA法法（186.1186.1）：每）：每mlml血液中加血液中加0.5mmol/L EDTA 20.5mmol/L EDTA 2l l。5体液标本采集：体液标本采集：在局部在局部70%70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。6膝关节腔穿刺膝关节腔穿刺 胸腔穿刺胸腔穿刺 血样中红细胞和白细胞的分离：血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉利用细胞的相对密度或大小不
4、同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。抗凝血，室温或抗凝血，室温或3737下直立静置下直立静置30-60min30-60min，红细胞沉降至下层，中，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与与3%3%明胶（经灭菌消毒）等量或明胶（经灭菌消毒）等量或3 3l l量混合于离心管中，直立静置量混合于离心管中，直立静置30-30-60min60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。，红细胞沉于管底，上
5、层乳白色混浊液含白细胞。78血中单个核细胞的分离：血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.0771.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液血中单核细胞的分离：血中单核细胞的分离：利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离9单单个个核核细细胞胞悬悬液液多将悬液放入多将悬液放入12cm12cm直径的培养直径的培养皿中，于皿中，于3737培养箱中静置培养箱中静置30-30-60m
6、in60min。此时单核细胞贴壁，而。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用壁细胞，并用HanksHanks液轻轻冲洗液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下培养皿以尽量洗下未贴壁细胞未贴壁细胞（淋巴细胞）。（淋巴细胞）。用用Hanks液强液强力冲洗吹打与力冲洗吹打与震荡，将贴壁震荡，将贴壁的单核细胞冲的单核细胞冲落或用刮刀轻落或用刮刀轻刮，收集刮，收集贴壁贴壁的单核细胞的单核细胞。计数后计数后分别制分别制备所需备所需浓度的浓度的细胞悬细胞悬液。液。黏附法分离血中单核细胞、黏附法分离血中单核细胞、T T，B B淋巴细胞淋巴细胞 10因因B B淋巴细胞和单核细胞能
7、黏附于淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与所以可将其与T T淋巴细胞分离。淋巴细胞分离。具体步骤：具体步骤：单个核细胞用含单个核细胞用含20%20%小牛血清小牛血清RPMI-1640RPMI-1640制成（制成（2.5-32.5-3）10107 7/ml/ml的的细胞悬液。细胞悬液。先用先用HanksHanks液，再用含液，再用含20%20%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。维柱，冲洗液尽量流净。将尼龙柱预温将尼龙柱预温3737，再用配制的单个核细胞悬液，再
8、用配制的单个核细胞悬液2ml2ml装入尼龙纤维装入尼龙纤维柱，不使流出，柱，不使流出，3737温箱内静置温箱内静置l l小时。小时。取下注射针头，用预温取下注射针头，用预温3737含含20%20%小牛血清的小牛血清的RPM I-1640RPM I-1640培养液冲培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T T淋巴细胞。淋巴细胞。从注射器内取出尼龙纤维，在从注射器内取出尼龙纤维，在44的的RPMI-1640RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的压，将黏附的B B细胞洗脱收集（细胞洗脱收集（B B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴淋巴细胞中混
9、有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。壁法将其分离）。收集的收集的T T、B B淋巴细胞可分别用淋巴细胞可分别用HanksHanks液悬浮，洗涤，离心（液悬浮，洗涤，离心（250g250g，7min7min），并重复洗涤），并重复洗涤3 3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的备所需浓度的T T和和B B淋巴细胞悬液。淋巴细胞悬液。11免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)(MACS)分离分离T T、B B淋巴细胞：淋巴细胞：磁性微珠是磁性微珠是2020世纪世纪8080年代初以高分子材料和金属离子（如年代初以高分子材料和金属离子（如FeFe3 3O O4
10、 4）为原料聚合而成的一种以为原料聚合而成的一种以金属离子为核心金属离子为核心、外层均匀地包裹、外层均匀地包裹高分子聚合高分子聚合体体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。即可制成免疫磁性微珠。12 免疫磁性微珠免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
11、上，待它与混合体系中的细胞反应特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。分离的目的。通常有二种分离方式：通常有二种分离方式：阳性分离阳性分离和和阴性分离阴性分离。阳性分离是直接从细胞。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。得以分离。13 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类
12、各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞、造血祖细胞(CD34)、单核、单核/巨噬细巨噬细胞胞(CD14)、胰岛细胞、胰岛细胞(胰岛胰岛GK和和GLUT2（葡萄糖转运子）（葡萄糖转运子）)、多种肿瘤、多种肿瘤细胞等。细胞等。14151617MACS技术优点技术优点：稳定、高质量的分选稳定、高质量的分选：纯度（：纯度（90-99%）对细胞无损伤对细胞无损伤操作简便、快速：操作简便、快速：消毒方便，手动分选消毒方便，手动分选30分钟内分钟内完成，完成，autoMACS分选分选2.5-10分钟之内完成。分钟之内完成。从实验室到临床：从
13、实验室到临床：MACS技术可以实现技术可以实现105-1011个个细胞分选。有细胞分选。有autoMACS和和CliniMACS。分选后细胞适用于后续实验：分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。组分均可回收利用。从细胞到分子分选：从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及及mRNA。18MACS技术缺点：技术缺点：l分离效率较流式细胞仪分分离效率较流式细胞仪分
14、选略低选略低l且耗材相对较贵，适合无且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。选细胞纯度要求不高的分选。l只适用于简单标记的细胞只适用于简单标记的细胞分离分离流式细胞术分离法分离流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：淋巴细胞：密度梯度离心法分离单个核细胞，用密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成培养基配成1107/ml；加适量加适量FITC-抗抗CD3或或FITC-抗抗CD19，4孵育孵育30min,用用RPMI-1640培养基洗培养基洗2次；次；用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光用流式细胞仪进
15、行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。19注意事项：注意事项：分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。此法分离得到的此法分离得到的T细胞纯度可达到细胞纯度可达到99%,收获率可达到收获率可达到90%。由于喷嘴孔很小（约由于喷嘴孔很小（约70100m），分选前用），分选前用3040m孔径的滤网孔径的滤网过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴
16、。20优缺点：优缺点：流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。流式分选成本比磁珠低。流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技流式分
17、选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。21二、从原代组织中分离细胞二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：组织和器官采集：人标本：人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。大量的动物组织：大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入先麻醉或处死，浸入70%70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下中线剪开
18、皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70%70%酒酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。动物的骨髓：动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。22制备细胞悬液方法：制备细胞悬液方法：将
19、组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及以及螯合剂解离螯合剂解离细胞法细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚酶解聚。细。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包括包括胰蛋白酶、胶原酶胰蛋白酶、胶原酶和和中性蛋白酶中性蛋白酶等。等。231.1.胰蛋白酶胰蛋白酶 (Trypsin)24在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，在去除不需要的组织后
20、，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗重复清洗2到到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。小块。将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在无钙镁的溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入组织加入1ml 胰蛋白酶）。胰蛋白酶）。25在在4孵育孵育6到到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去去移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含残留孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片胰蛋白酶的组织碎片20到到30分钟分钟 在组织碎
21、片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂 通过无菌不锈钢丝网（通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培目）过滤，计数和接种细胞，进行培养养 2.2.胶原酶胶原酶 (Collagenase)(Collagenase)26用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用小块，用Hanks平衡液平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次）清洗组织碎片几次 加入胶原酶（加入胶原酶（50200单位单位
22、/ml，溶解在，溶解在HBSS中）中）在在37孵育孵育4到到18小时。加入小时。加入3mM CaCl2增加解离效率增加解离效率 27通过离心在通过离心在HBSS中清洗悬液几次中清洗悬液几次 再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶 3.3.中性蛋白酶中性蛋白酶(Dispase)(Dispase)28用
23、无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次盐溶液清洗组织碎片几次 加入加入Dispase（0.62.4单位单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在在37孵育孵育20分钟到几个小时。分钟到几个小时。29通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase 通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次通
24、过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次 再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养 举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法）:30无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等 用用D-Hanks液（无液（无Ca2+、Mg2+，含青霉素，含青霉素200kUL-1、链霉素、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成）反复冲洗后剪成12mm3小块，离心洗涤小块，离心洗涤2 次次置于加入置于加入2ml含含10%胎牛血清、胎牛血清、0.4%型胶原酶的型胶原酶的DMEM培养液的培培养液的培养瓶中，
25、在养瓶中，在37、5%CO2培养箱中消化培养箱中消化2h，每隔，每隔10min吹打吹打1 次。次。31再加入含再加入含0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶的D-Hanks液液4ml，培养消化，培养消化30min 将培养液移至离心管中，将培养液移至离心管中，1200rpm离心离心10min，弃上清，弃上清 200目尼龙网纱过滤，目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心离心10min，弃上清，弃上清 将获得的细胞在将获得的细胞在37、5%CO2培养箱中培养培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞，弃去未黏附细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细
26、胞 4.4.组织块培养法组织块培养法举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：32无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hanks液（含液（含青霉素青霉素200kUL-1、链霉素、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成）反复冲洗后剪成12mm3小块小块 用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20胎牛血清胎牛血清DMEM培养液培养液湿润）的底壁，瓶底朝上，湿润）的底壁，瓶底朝上，37、5%CO2培养箱中培养培养箱中培养3h，使其贴壁，使其贴壁 33待细胞快长满时用待细胞快
27、长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，胰蛋白酶消化细胞并传代培养，取第取第35代细胞用于实验代细胞用于实验观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养轻轻翻转培养瓶，轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔使培养液刚刚覆盖组织块，每隔23天换一次培养液天换一次培养液34培养培养24h培养培养96h培养培养120h举例（初步淋巴细胞分离法）：举例（初步淋巴细胞分离法）：35放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛有含有含5%小牛血清的小牛血清的D
28、-Hanks液（不含钙镁，含青霉素液（不含钙镁，含青霉素200kUL-1、链、链霉素霉素200mgL-1）平皿的网纱中（）平皿的网纱中（200目）目）用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中溶液移入离心管中，溶液移入离心管中，1200 rpm离心离心10min，弃上清，弃上清，D-Hanks液洗涤液洗涤细胞，加入细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养培养液计数和调节细胞浓度，进行培养 举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）：举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）：基本原理基本原理：心肌细胞培养方法有心肌细胞培养方法有离体
29、心脏灌注法离体心脏灌注法、酶消化法酶消化法和和组织块法组织块法，将心，将心肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。36评价评价：离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大;酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是能得到大量单细胞；是能得到大量单细胞；组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。组织块法操作简单，实
30、验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。37心肌细胞的酶消化培养法：心肌细胞的酶消化培养法：1.心肌组织的选择：心肌组织的选择：生后生后14天的天的Wistar乳鼠心脏等。乳鼠心脏等。2.心肌组织块的制备：心肌组织块的制备：乳鼠用乳鼠用75%乙醇乙醇/1%新洁尔灭消毒皮肤，新洁尔灭消毒皮肤，无菌开胸无菌开胸，暴露心脏暴露心脏，于，于心脏收缩期剪下心脏，置于盛心脏收缩期剪下心脏，置于盛D-Hanks 液的培养皿中，剪开心脏，清洗液的培养皿中，剪开心脏，清洗三次，以去除血污。三次，
31、以去除血污。383.心肌细胞悬液的制备：心肌细胞悬液的制备：取心尖部组织（心室）剪为取心尖部组织（心室）剪为1mm3碎块，在大离心管中放入组织碎块，碎块，在大离心管中放入组织碎块，加入加入0.06%0.25%的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液815ml，在磁力搅拌器上，在磁力搅拌器上，37水浴水浴消化消化10min，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶，消消化化10min，静置后将上清液移入盛有，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清培养液的离心管中新生牛血清培养液的离心管中终止消化，并以终止消化，并以1000rpm离心离心10min，弃上清
32、，用培养液充分吹打成单细，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止，分次收获心肌细胞。化为止，分次收获心肌细胞。394.心肌细胞悬液的接种：心肌细胞悬液的接种：将分次收获的心肌细胞用将分次收获的心肌细胞用Hanks 液离心清洗液离心清洗12 次，弃上清液。将次，弃上清液。将沉淀细胞定量加入培养基沉淀细胞定量加入培养基35 mL，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，37、5%CO2
33、 培养箱培养。培养箱培养。5.细胞纯化：细胞纯化：培养培养2 h，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；2 h 后，后，去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。心肌细胞。40心肌细胞的贴块培养法：心肌细胞的贴块培养法：1.取材：取材：按前述方法取出心脏，置于盛按前述方法取出心脏，置于盛Hanks 液的培养皿中，清液的培养皿中，清洗三次。洗三次。2.贴块：贴块：将心脏剪为将心脏剪为1mm3大小的小块，移入培养瓶底面，用无菌大小的小块，移入培养瓶底面，用
34、无菌牙科探针将其均匀铺开。牙科探针将其均匀铺开。3.干固：干固：盖上瓶盖，盖上瓶盖，37 烤箱培养瓶翻转干固烤箱培养瓶翻转干固11.5 h。4.接种培养：接种培养：添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加足培养液。足培养液。4142三、从原培养容器中分离细胞（传代培养）三、从原培养容器中分离细胞（传代培养）贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。多
35、堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。43 对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（HEK）293细胞等，可以直接吹细胞等，可以直接吹散后分瓶散后分瓶;对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、滑膜细胞）细胞、滑膜细胞（Synoviocytes）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按无菌操作的要求进行）：无菌操作的要求进行）：4445将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去 加入加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为胰
36、酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使或更多，以使充分浸润充分浸润一般消化时间约为一般消化时间约为1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化化，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例 胰酶消化的程度是一个关键：胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂
37、浮，消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。复吹打同样也会损伤细胞活性。46影响消化速度的因素：影响消化速度的因素：主要有主要有胰酶溶液的活性胰酶溶液的活性（配制条件、（配制条件、冻存或冻存或4保存时保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加所加胰酶溶液的多少胰酶溶液的多少等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考（以出以供参考（以CHO细胞为例）。细胞为例）。4748复苏后细胞复苏后细胞培养培养24h培养培养48h刚加胰酶刚加胰酶开始皱缩开始皱缩明显皱缩明显皱缩基本变圆基本变圆完全变圆完全变圆
