1、一、名词：1. 转座子转座因子或转座子是存在于基因组中可移动的一段不连续序列，可将其本身在基因组内从一个位置转移到另一个位置。转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子(retrotransposon)。转座途径有两种：复制转座和非复制转座。2. miRNAmicroRNAs（miRNAs）是一种类似于siRNA，长约21到23个核苷酸，由含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后形成的一类非编码的小RNA分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译，调控发育过程。3. CpG岛海滩
2、基因组中长度为3003000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5区域。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，CpG岛经常出现在真核生物的house-keeping基因的调控区。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基化可导致基因转录被抑制。4. 系统生物学以整体性研究为特征的一种大科学，是在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为。5. 基因组在个体水平代表个体所有遗传性状的总和；在细胞水平，是一个细胞所有染色体的总和；从分子
3、角度认识，它代表了一个物种的所有DNA分子的总和。6. Real time PCR(实时定量PCR)实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。7. Threshold Cycle (Ct)PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。模板起始浓度越高，Ct值越小；Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系。8. 同尾酶即能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。所有钝末端酶产
4、生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。故名思义，同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。9. DDRP即DNA依赖的RNA聚合酶(DNA- dependent RNA polymerase，DDRP)。它是以一条DNA链为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。合成方向也是53，无需引物，无校对功能。10. 调节基因调节基因是参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。调节基因编码的调节物质通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调
5、控的方式调节靶基因，也能以负调控的方式调节靶基因。11. 组成型表达即指组成型基因（也叫管家基因，housekeeping genes）的表达，其表达产物大致以恒定水平始终存在与细胞内。其速率不受环境变化或代谢状态的影响。12. 遗传密码摆动性tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，并不严格遵循配对原则，例如I可以与密码子上3端的U，C和A配对，这种现象称为密码的摆动性。13. Nucleosome即核小体，构成真核染色质的一种重复珠状结构，是由大约200 bp的DNA区段和多个组蛋白组成的大分子复合体。其中大约146
6、bp的DNA区段与八聚体(H2A、H2B、H3和H4各两分子)的组蛋白组成核小体的核心颗粒，核心颗粒间通过一个组蛋白H1的连接区DNA彼此相连，是染色质的基本结构单位。14. chromatin remodeling染色质重组装（chromatin remodelling）是指染色质或核小体的结构、成分变化，这些变化具有转录调控等作用。有以下2方面调节方式： 核小体水平的调节(10-30 nm)，大规模染色质（large-scale chromatin）水平的调节：大于核小体范围(30 nm)。15. 表观遗传表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传
7、的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。16. Kozak sequence存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是核糖体结合位点，而是帽子结构。加Kozark sequence(GCCACC),kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。A/GCCAUGG被称为kozak序列。17. caspase 即天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，是一组存在于细胞质中，具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱氨
8、酸残基，能够特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase负责选择性切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。Caspase蛋白家族在caspase依赖性的细胞凋亡中发挥重要作用，有两类caspase，一类是凋亡起始者，一类是凋亡执行者。起始的caspase对执行者caspase进行切割并激活，被激活的执行者caspase通过对caspase靶蛋白水解导致细胞程序性死亡。18. Cdkcyclin-dependent kinases，即周期蛋白依赖性蛋白激酶，是一组丝、苏氨酸蛋白激酶，和周期蛋白cyclin协同作用，是细胞周期调控中的重要因子。CDK可以和cyclin结合形成异二聚体，其中CDK
9、为催化亚基，cyclin为调节亚基，不同的cyclinCDK复合物，通过CDK活性，到底不同底物磷酸化，而实现对细胞周期不同时相的推进和转化作用。19. APC/C complex即后期促进复合物，是一种多亚基的E3泛素连接酶性质的蛋白质复合物，其通过泛素依赖性蛋白降解途径降解参与姐妹染色单体分离的蛋白质，使细胞从中期像后期转换。20. ubiquitin 泛素：真核细胞中的高度保守的热稳定的小分子蛋白，具有76个氨基酸残基。通过与要降解的蛋白质的赖氨酸残基共价连接，指导蛋白质在蛋白酶体中进行降解。21. Proteasome（强调一下在泛素化中）蛋白酶体(proteasome) 是在细胞质基
10、质中降解被泛素标记蛋白质的大分子蛋白复合体。22. 模式生物（model organism）作为实验模型以研究特定生物学现象的动物、植物和微生物。用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。从研究模式生物得到的结论，通常可适用于其他生物。目前应用广泛的模式生物包括噬菌体、大肠杆菌、线虫、果蝇、斑马鱼等。23. 条件基因打靶（conditional gene targeting）条件基因打靶（conditional gene targeting）：通过同源重组和位点特异性重组技术在特定细胞类型或者特定发育阶段对基因进行定位修饰的实验技术。24. 癌基因癌基因（on
11、cogene）通常表示原癌基因的突变体，这些基因编码的蛋白使细胞的生长失去控制，并转变成癌细胞，故称癌基因。25. 抑癌基因 编码对肿瘤形成起阻抑作用的蛋白质的基因。正常情况下负责控制细胞生长和增殖，防止细胞癌变。当这些基因不能表达或者其产物失去活性时，可导致细胞癌变。如p53基因和成视网膜细胞瘤基因(Rb基因)是最重要的两种抑癌基因。26. 基因突变基因突变（gene mutation）是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变，就叫做基因突变。1个基因内部可以遗传的结构的改变 。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化 。广义的突变包括染色体畸变，狭义的突变专指点
12、突变。 27. 复制酶复合体(Replicase complex, RC)由PA,PB1和PB23个亚基组成的聚合酶复合体是负责病毒基因组RNA复制以及病毒mRNA转录的关键组分，同时由于它的高度保守性、低突变率，成为抗流感病毒药物设计的重要靶点。其中PB1是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制以及转录；PB2是负责以一种称为“Snatch”的方式夺取宿主mRNA的CAP帽子结构用于病毒mRNA转录。而PA亚基不但参与病毒复制过程，而且还参与病毒RNA转录、内切核酸酶活性、具有蛋白酶活性以及参与病毒粒子组装等多种病毒活动过程。28. (病毒)多聚蛋白（polyprotein）指有些
13、病毒的RNA翻译时，最先合成一个分子质量很大的前体蛋白质，即病毒多聚蛋白，然后由专一的蛋白酶加工裂解，产生多种成熟的蛋白质，如豇豆花叶病毒属、线虫传多面体病毒属、芜菁黄花叶病毒属和马铃薯Y病毒科的病毒等。除了芜菁黄花叶病毒（TYMV）外，病毒多聚蛋白5端均为VPg，3端为Poly（A）。29. (病毒)RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）RdRP是一种以一条RNA链为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶，它催化合成给定RNA模板的互补链，其模版特异性很高，只识别病毒自身的RNA。在遗传物质不是DNA而是RNA的病毒中这种酶至关重要。3
14、0. 免疫共沉淀免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）即依据抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的性质，在抗原抗体结合后，利用固相化的蛋白A或蛋白G小珠等来吸附分离抗原抗体复合体，达到检测微量抗原或抗体的目的的一种蛋白检测方法。二、问答题：1. 简述DNA测序技术的发展历程，以及不同测序技术的原理和特点。DNA测序技术发展至今已经历三代。第一代测序技术：第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam） 和吉
15、尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。原理：对于Sanger法，通过引入双脱氧核苷酸ddNTP作为终止剂，且四种核苷酸标记上不同颜色荧光，电泳后由颜色读出序列；对于化学法，通过几组互相独立的的化学反应特异地针对某一种或某一类碱基，使DNA降解为长短不一的片段。此后各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。特点：成本较高、低通量、测序耗时大。第二代测序技术即循环阵列合成测序法。原理：其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。一种流行的方法是在sanger等测序方法的基础上，用不同的荧光或者化学荧光标记四种不同的dNTP，
16、当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，采用光学采集和处理技术，获得待测的DNA序列信息。特点：高通量、快速、低成本。第三代瞬时测序新技术。原理：基于纳电子技术的DNA测序构想，即利用核苷酸上不同碱基的电子结构不同。DNA分子是带电的大分子，在纵向电场的驱动下，将游动通过纳米孔。在此期间，同时测量纳米孔里横向的隧穿电流，不同核苷酸的碱基电子结构不同，由此导致的横向电学特性也不同，据此可以判断出正在通过的是哪一种核苷酸。特点：快速、高效、可靠。2. 简述肿瘤基因治疗的基本策略。基因治疗的基本策略：取决于肿瘤的类型，概括起来有下列五种：基因置换：用正常的外源基因置换产生
17、疾病的基因，使致病基因得到永久的更正。此为最理想的基因疗法。基因修正：单基因遗传病在多数情况下是由于基因内部单个碱基发生突变所致，而其他核苷酸序列均正常，因此只要将突变的单个碱基予以更正就能达到基因治疗的目的，而不必将整个基因进行置换。基因修饰：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物可以补偿病变基因的功能，而病变基因本身并未改变。由于已经发展了许多有效的方法可以将目的基因导入真核细胞，并获得表达，因而是目前较为成熟的方法。基因抑制：导入外源基因去干扰、抑制有害基因的表达。基因封闭：以mRNA 为靶分子，用特定的可与靶分子互补的DNA或RNA分子与mRNA形成双链，从而改变RNA的
18、剪接方式 ，阻断翻译甚至摧毁异常RNA，在剪接或翻译水平上调节基因的表达。3. 简述转化医学研究的流程。转化医学（Translational Medicine），也称转化研究（Translational Research, TR）。它是一门新兴学科，涵盖从基础科学到临床应用的方方面面，所以有人形象地将转化医学称为“从实验台到病床（Bench to Bedside, B2B）”的科学。转化医学的主要目的就是将基础研究与临床研究联系起来，弥合他们之间的界限。图04. 简述基因表达调控的生物学意义。(一) 适应环境、维持生长和增殖生物体赖以生存的外环境是在不断变化的，为了生存，所有活细胞都必须对外环
19、境变化作出适当反应，调节代谢，以适应环境变化。生物体适应环境、调节代谢的能力与蛋白质分子的生物学功能有关。而蛋白质的水平又受基因表达的调控。(二) 维持个体发育与分化多细胞生物调节基因的表达除为适应环境外，还有维持组织器官分化、个体发育的功能。当某种基因缺陷或表达异常时，则会出现相应组织或器官的发育异常。5. 简述原核生物基因转录过程并举例说明抗生素的原理。原核生物基因转录过程分为四个阶段：模版的识别、转录的起始、转录的延伸和转录的终止。1.模板的识别：RNA聚合酶在亚基引导下识别并结合到启动子上，然后DNA双链被局部解开，形成的解链区称为转录泡。 2.转录的起始：指RNA链的第一个核苷键的合
20、成。酶继续结合在启动子上，起催化中心在模板链上通过碱基配对合成RNA链最初29个核苷酸，随后亚基脱离核心酶，后者离开启动子，起始阶段结束；3.转录的延伸：RNA Pol继续沿着模板链从5到3方向移动，解链区也随着移动，RNA链不断生长；4.转录的终止：RNA聚合酶到达基因转录终点，在Nus A因子（亚基）帮助下识别转录终止信号，停止RNA链的生长，酶与RNA链离开模板，DNA恢复双螺旋结构。 抗生素作用原理：（1）抑制细胞壁的形成，如青霉素，主要是抑制细胞壁中肽聚糖的合成。多氧霉素（一种效果很好的杀真菌剂）主要作用是抑制真攻细胞壁中几丁质的合成。 （2）影响细胞膜的功能，如多粘菌至少与细胞结合
21、，作用于脂多糖、脂蛋白，因此对革兰氏阴性菌有较强的杀菌作用，制霉菌素与真菌细胞膜中的类固醇结合，破坏细胞膜的结构。 （3）干扰蛋白质的合成，通过抑制蛋白质生物合成抑制微生物生长的抗生素较多，如卡那霉素、链霉素等。 （4）阻碍核酸的合成，主要通过抑制DNA或RNA的合成，抑制微生物的生长，例如利福霉素、博莱霉素等。6. 简述蛋白质合成的自体调控。一种蛋白质或RNA调控其自身的表达，即为自体调控。细菌编码核糖体蛋白质、蛋白质合成因子和RNA聚合酶亚基等蛋白质的基因混合组成几个操纵子。每个操纵子都含有数个基因。这些操纵子的表达都受操纵子自身的一些基因产物的调控。操纵子自身编码的蛋白质的富集会抑制其自
22、身及一些相关基因产物的进一步合成。 RF2是原核生物中催化翻译终止作用的特殊蛋白质因子，它可识别终止密码子UGA和UAA。RF2的结构基因一共编码340个氨基酸，但其密码子并不连续排列，而是在第 25位和26位密码子之间多了一个U，这个U可以同第26位密码子头两个核苷酸组成终止密码子UGA，而为RF2所识别。在细胞内RF2充足的条件下，核糖体A位进入到第25个密码子后的此UGA处便终止RF2的合成，释放只有25个氨基酸的短肽，不具RF2的终止活性。如果细胞内RF2不足，核糖体就会以1的移码机制将第26位密码子译成天冬氨酸（Asp），并完成整个RF2的翻译。可见，RF2作为一个调节蛋白，可根据自
23、身在细胞内的丰欠程度决定其翻译是连续还是半途而废。7. 如何确定某一蛋白质具有转录活性？转录因子转录活性的测定1 与异源DNA结合结构域融合图12 利用含转录因子应答元件（responsive elements）的报告基因应答元件(responsive elements)：一组受共同转录因子调控的基因，各基因都有一个相同的序列元件，该元件是转录因子识别靶基因的位点。图28. p53和Rb在细胞周期调控中的角色及其与肿瘤发生发展的关系。野生型P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要的作用。P53时刻监控着细胞染色体DNA的完整性，一旦细胞染色体DNA遭到损害，P53蛋白与基因的DNA
24、相应部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，使细胞停滞在G1期；抑制解链酶活性；并与复制因子A相互作用，参与DNA的复制与修复。如果修复失败，P53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向突变的细胞生成，从而防止细胞恶变。当P53基因发生突变后，由于空间构象改变影响到转录活化功能及P53蛋白的磷酸化过程，这不仅失去野生型P53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因功能。突变的P53蛋白与野生型P53蛋白相结合，形成的这种寡聚蛋白不能结合DNA，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。Rb作为具有抑癌作用的细胞周期调控因子，对细胞的周期调控与P53类似。当细胞染
25、色体受损，则RB抑制促进E2F，使细胞停滞在G1期。而当Rb突变后，对E2F的抑制降低。此时E2F对细胞从G1期到S期的促进作用增强，使得细胞增殖加速，进而诱发癌变。9. 简述Cullin类泛素连接酶的组织模式和作用机制。组织模式：1.cullin-作为支架蛋白 2.ROC-形式RING finger结构，连接cullin与泛素交联酶E2 3.Skp1，延伸因子B/C，BTB，DDB1-接头蛋白，连接cullin与底物受体 4.F-box，VHL，SOCS，BTB，DWD蛋白-底物受体，连接接头蛋白和底物 5.底物-泛素连接酶E3靶向（大部分未知，仅大约20种被确定）作用机制：首先ROC与cu
26、llin结合，连接cullin与E2，随后Skp1携带F-box蛋白与cullin 1结合，而F-box蛋白作为底物受体，由与ROC结合的泛素交联酶E2将泛素连接到目的降解底物上，从而使底物被多泛素链标记，进而被蛋白酶体所识别乃至被降解。10. apoptosis和necrosis有哪些异同？相同点：本质都是细胞的程序性死亡过程，只是形式不同。都具有一定的发生形成阶段，都是不可复性的生理或病理变化。不同点：表111. 新基因功能的研究的主要策略以及相应的主要研究手段。基因功能的研究策略主要包括新基因的生物信息学及体内表达规律分析、功能获得与功能失活策略研究、基因编码产物相互作用蛋白的研究。从核
27、酸水平上：利用Northern杂交、原位杂交、RT-PCR、mRNA表达差异显示技术研究基因的表达模式。利用报告基因和缺失突变分析鉴定基因的调控序列。用Gel retardation、DNase 足迹分析研究DNA上的蛋白质结合位点。在蛋白质水平上：利用抗体检测基因的表达模式。蛋白质工程是研究基因功能的有效手段。利用免疫共沉淀、噬菌体表面呈现技术、酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。利用染色质免疫沉淀研究蛋白质与DNA的相互作用。蛋白质组学研究。在生物整体水平上：利用转基因及基因打靶技术研究生物发育和疾病发生过程中的功能及其机制。12. 基因打靶技术的原理、主要策略以及主要流程。原理
28、:通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。策略:基因敲除（ES细胞，体细胞）精细突变的引入染色体组大片段的删除基因敲除的时空调控大规模随机基因敲除-基因诱捕大规模随机诱变研究-ENU诱导的点突变
29、在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶流程：体外对ES 细胞遗传物质进行定向修饰中靶ES细胞经显微注射引入受体囊胚携带中靶ES的囊胚经胚胎移植引入假孕鼠子宫种系嵌合体的鉴定以及基因打靶小鼠的表型分析13. 酵母双杂交的原理、主要策略以及应用。酵母双杂交技术：许多真核生物的转录激活因子通常具有两个可独立存在的结构域，即DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的能激活特定基因表达的转录激活因子必须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的BD区与AD结合在一起可特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合
30、蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。14. 转基因小鼠研制的原理、主要流程以及应用。可以通过基因转移技术将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而借助受体动物表达外源基因。流程：图3应用：基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究基因工程定向育种转基因动物生物反应器研制 人类疾病小鼠模型与基因治疗药理学研究器官移植环境科学研究15. 病毒使细胞恶性转化的途径有哪些？病毒使正常细胞转化为恶性主要通过病毒癌基因编码产物癌蛋
31、白对细胞各部分发生作用。 （1）作用细胞膜 有的病毒癌基因产物为生长因子或其受体类似物，可不断刺激细胞进行增殖。 （2）跨膜信号传导 有的病毒癌基因产物具有类似G蛋白的作用，但不能有效地调节信号输入，而处于持续信号传入状态。 （3）作用细胞质 有的病毒癌基因产物本身为蛋白激酶，通过胞质蛋白激酶的磷酸化而影响细胞第二信使的产生。 （4）作用细胞核 正常细胞核内存在核蛋白和核受体，一些病毒癌基因本身为核蛋白，核受体或转录因子，参与转录及DNA合成的改变。16. 请结合2011年度诺贝尔生理学或医学奖的研究工作，简述TLR受体及其在抗感染天然免疫中的功能。TLR又称Toll样受体，是I型跨膜蛋白质，
32、胞外段富含亮氨酸重复序列，参与配体识别，胞内段含有保守的TIR结构域，招募衔接分子如MYD88等进行信号传导。TLR是结合病原微生物成分的受体，其所识别的病源微生物成分（PAMP）有脂多糖，脂磷壁酸等。在人类体内已发现10种TLR，表达与参与天然免疫的细胞上，不同的TLR在不同的细胞表面有不同的表达，所识别的配体也不同。这类模式识别受体可与病原体PAMPs结合，并启动细胞内信号传导，导致效应分子表达和分泌。TLR介导的信号传导可导致固有免疫细胞活化，产生两方面效应，其一，表达和分泌多种称之为促炎症细胞因子（proinflammatory cytokine），如肿瘤坏死因子（tumor necr
33、osis facter，TNF-），白细胞介素(IL)-12，IL-6等。这些细胞因子可诱导炎症发生，促进抗原提呈，促进T辅助细胞（T helper cell，Th）发生Th1或Th2的格局变化；其二，可诱导共刺激分子（co-stimulatory molecule）表达，启动特异性免疫应答产生。17. 简述丙型肝炎病毒(HCV)的复制周期以及哪些过程(阶段)可以作为抗病毒药物研究靶标。HCV归类于黄病毒属，是一种有包膜的病毒。HCV的复制周期课分为4个阶段：（一） 进入宿主细胞 HCV的包膜包含E1和E2两种病毒糖蛋白，通过C端疏水键嵌合于脂质包膜上。HCV包膜包裹着核壳体，后者由HCV的核
34、心蛋白和9.6kb基因组RNA组成。（二） HCV基因组的翻译和多聚蛋白的加工处理 HCV基因组RNA的翻译是HCV复制周期中可被用来进行针对性干预的环节之一。翻译起始受一种高度保守RNA序列所介导，此RNA序列作为内在的核糖体进入位点（IRES），能直接结合起始因子eIF和40S核糖体亚单位，因此IRES可有效地调控无帽HCV基因组RNA的翻译，常被用作抗病毒干预的靶位。多聚蛋白的加工处理对形成有活性的HCV RNA复制酶非常重要，2种病毒蛋白酶可被作为抗病毒药物作用的靶位。（三） HCV RNA的复制 HCV RNA复制酶是由HCV编码的NS3-NS5B和一些附加的、功能不明的宿主细胞成分
35、所组成。HCV复制酶的主要成分为NTP酶/解旋酶和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）。目前对这两种酶的生化特性进行了广泛研究，并生成了高清晰度的分子结构图，有助于抗HCV药物的研制和开发。（四） 病毒颗粒的装配与释放18. 简述冠状病毒(coronavirus)的复制周期以及病毒基因组转录的特点。 冠状病毒的核酸为非节段单链（+）RNA，RNA链5端有甲基化“帽子”，3端有PolyA “尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了RNADNARNA的转录过程。 冠状病毒成熟粒子中，并不存在RNA病毒复制所需的RNA聚
36、合酶（Viral RNA polymerase），它进入宿主细胞后，直接以病毒基因组RNA为翻译模板，表达出病毒RNA聚合酶。再利用这个酶完成负链亚基因组RNA（sub-genomic RNA）的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，以及病毒基因组RNA的复制。冠状病毒各个结构蛋白成熟的mRNA合成，不存在转录后的修饰剪切过程，而是直接通过RNA聚合酶和一些转录因子，以一种“不连续转录” 的机制，通过识别特定的转录调控序列（transcription regulating sequences, TSR），有选择性的从负义链RNA上，一次性转录得到构成一个成熟mRNA的全部组成部分。结构蛋白和基
37、因组RNA复制完成后，将在宿主细胞内质网处装配（assembly）生成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完成其生命周期。19. 简述蛋白质-DNA相互作用分析方法。在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase I 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、染色质免疫沉淀。 凝胶阻滞实验又叫做DNA迁移率变动试验是用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。原理是某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质后，由于分子量的加大它
38、在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带。DNA足迹实验体外鉴定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的方法，基本原理：DNA分子上的特定序列与DNA结合蛋白结合后，该特定DNA序列受到保护而将不被DNaseI消化。甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。染色质免疫共沉淀基于抗原抗体的特异性结合，与蛋白质交联的DNA序列会随着目的蛋白的沉淀而沉淀。研究蛋白质/ 核酸相互作用近期采用的新技术有：核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等。20. 简述RNA结合蛋白的典型结构。
